Сравнительная эффективность цитофлавина и его составных компонентов при окислительном стрессе в эксперименте

Опубликовано в журнале:
Экспериментальная и клиническая фармакология 2017 Том 80 №4 С. 18-22

В. А. Доровских, Н. В. Симонова, Д. И. Переверзев, М. А. Штарберг^1
1ФГБОУ ВО Амурская государственная медицинская академия Минздрава РФ, Россия, 675000, Благовещенск, ул. Горького, 95.

В экспериментальных условиях исследована возможность коррекции свободнорадикального окисления липидов мембран организма крыс введением цитофлавина. Установлено, что ежедневное ультрафиолетовое облучение в течение 3 мин способствует повышению содержания гидроперекисей липидов, диеновых конъюгатов, малонового диальдегида на фоне снижения активности основных компонентов антиоксидантной системы в крови экспериментальных животных. Введение крысам цитофлавина в дозе 100 мг/кг внутрибрюшинно ежедневно в течение 14 дней непосредственно перед облучением способствует достоверному снижению в плазме крови концентрации гидроперекисей липидов на 23-25%, диеновых конъюгатов — на 23-25%, малонового диальдегида — на 24-27% по сравнению с показателями контрольной группы (р<0,05). При анализе влияния цитофлавина на активность компонентов антиоксидантной системы установлено, что содержание церуло-плазмина и витамина Е в крови животных достоверно выше аналогичного показателя у крыс контрольной группы на 32-37% (р<0,05). Таким образом, использование цитофлавина в условиях окислительного стресса приводит к стабилизации процессов пероксидации на фоне повышения активности основных компонентов антиоксидантной системы в крови.
Ключевые слова: цитофлавин; окислительный стресс; ультрафиолетовое облучение; перекисное окисление липидов биологических мембран; продукты пероксидации (гидроперекиси липидов; диеновые конъюгаты; малоновый диальдегид); антиоксидантная система; крысы.

Введение

Проблема свободнорадикальной патологии в условиях ультрафиолетового облучения (УФО) имеет исключительно важное научное и практическое значение, поскольку ультрафиолетовые (УФ) лучи подвергают модификации клеточные мембраны, проницаемость мембран и мембранных транспортных систем, вызывая окисление ненасыщенных жирных кислот и накопление токсических продуктов радикального характера, что играет важную роль в развитии многих заболеваний [11, 13]. Повреждение жизненно важных ионных насосов при УФО влияет на многие процессы, основанные на ионном гомеостазе, способствует формированию патологических изменений, связанных с нарушением окислительно-восстановительных процессов при тканевом дыхании и дефицитом макроэргов [12]. В этих условиях, на наш взгляд, целесообразным является применение препаратов, содержащих янтарную кислоту, улучшающих окислительный метаболизм, активизирующих внутриклеточный синтез нуклеиновых кислот и ферментативные процессы цикла Кребса, способствующих утилизации глюкозы, синтезу и внутриклеточному накоплению аденозинтрифосфата (АТФ) и других макроэргов, необходимых для восстановления мембранных структур при облучении. Сукцинатсодержащие препараты снижают интенсивность процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), поскольку янтарная кислота, являясь антиоксидантом, блокирует активность свободных радикалов [1, 4, 8]. Учитывая вышесказанное, экспериментальное обоснование эффективности применения цитофлавина (НТФФ “ПОЛИСАН”, Санкт-Петербург, Россия) для коррекции процессов ПОЛ, индуцированных воздействием УФ лучей, является актуальным и открывает перспективы в регуляции различного рода стрессовых воздействий.

Цель работы — изучение антиоксидантной активности цитофлавина и его составных компонентов в условиях экспериментального окислительного стресса.

Методы исследования

Опыты проводили в течение 14 дней на 140 белых беспородных крысах-самцах массой 180-220 г, полученных из питомника ЦНИЛ АГМА, Благовещенск. Животных содержали в виварии при естественном освещении в условиях контролируемой температуры (22±2) °С и влажности (65±10) % воздуха при свободном доступе к воде и стандартному корму. Эксперименты проведены в соответствии с Национальным стандартом Российской Федерации ГОСТ Р 53434-2009 “Принципы надлежащей лабораторной практики”, Приказом Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23 августа 2010 г. № 708н “Об утверждении правил лабораторной практики”. Исследование одобрено Этическим комитетом Амурской государственной медицинской академии, соответствует нормативным требованиям проведения доклинических экспериментальных исследований (протокол № 6 от 12.11.2014).

УФО животных осуществляли ежедневно в условиях УФ камеры, длительность экспозиции — 3 мин [2]. Животные были разделены на 7 групп, в каждой по 20 животных: 1 группа — интактная, животных содержали в стандартных условиях вивария; 2 группа — контрольная, животных подвергали УФО в течение 3 мин ежедневно в течение 14 дней на фоне ежедневного внутрибрюшинного введения животным непосредственно перед облучением эквиобъемного вводимому препарату цитофлавин (7 группа) 0,9% раствора натрия хлорида (0,2 мл/200 г); 3, 4, 5, 6, 7 группы — опытные, животным непосредственно перед облучением (время экспозиции 3 мин) ежедневно внутрибрюшинно вводили, соответственно, янтарную кислоту в дозе 100мг/кг (3 группа), рибоксин в дозе 10 мг/кг (4 группа), рибофлавин в дозе 2 мг/кг (5 группа), никотинамид в дозе 10 мг/кг (6 группа), цитофлавин в дозе 100 мг/кг по сукцинату (7 группа).

Цитофлавин (раствор для внутривенного введения производства НТФФ “Полисан”, Санкт-Петербург, Россия) является сбалансированным комплексом из 2 метаболитов (янтарная кислота, рибоксин) и 2 коферментов витаминов (рибофлавин мононуклеотид — витамин В₂, никотинамид — витамин РР). Крыс декапитировали на 7, 14 дни эксперимента. После декапитации животных кровь собирали в охлажденные пробирки с гепарином, центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин, полученную сыворотку крови хранили при температуре -20 °С до момента исследования. Интенсивность процессов ПОЛ оценивали, исследуя содержание гидроперекисей липидов, диеновых конъюгатов (по методикам, разработанным И. Д. Стальной [14, 15]), малонового диальдегида (по цветной реакции с тиобарбитуровой кислотой [16]) и основных компонентов антиоксидантной системы (АОС) — церулоплазмина по методике В. Г. Колба [6], витамина Е по методике Р. Ж. Киселевич [5], каталазы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы — по методикам [7] в модификации Е. А. Бородина в сыворотке крови крыс. Статистическую обработку результатов проводили с использованием критерия Стъюдента (t) с помощью программы Statistica v.6.0. Результаты считали достоверными при р<0,05.

Результаты и их обсуждение

В результате проведенных исследований установлено, что воздействие УФ лучей на крыс сопровождается активацией процессов ПОЛ и накоплением продуктов пероксидации в крови облучаемых животных: увеличением содержания гидроперекисей липидов на 53,48% к концу первой и второй недель эксперимента соответственно относительно интактных крыс (р<0,05), диеновых конъюгатов — на 48,43%, соответственно (р<0,05), малонового диальдегида — на 61, 48% (р<0,05) (табл. 1, 2). Активация ПОЛ при УФО крыс развивается на фоне напряжения и истощения АОС крови, характерные изменения которой включают уменьшение содержания церулоплазмина (на 33,36% на 7, 14 день опыта) и витамина Е (на 31% к концу первой и второй недель), снижение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (на 15-19%) и каталазы (на 31-32%) (р<0,05) (табл. 3, 4), что свидетельствует о формировании окислительного стресса в теплокровном организме в условиях воздействия УФ лучей и связано, на наш взгляд, с образованием свободных радикалов из валентно-насыщенных молекул липидов в биологических системах на начальной стадии зарождения цепей в условиях УФО. Поскольку в фотоэлектрических процессах УФ лучи выбивают электрон с внешней орбиты атомов клеточных молекул, превращая их в положительно заряженные ионы, перераспределение электронов становится пусковым звеном в инициировании процессов пероксидации, результатом которого является изменение “ионной конъюнктуры” в клетках и тканях, нарушение электрических свойств биоколлоидов и изменение их агрегатного состояния. Все это приводит к повышению проницаемости клеточных мембран под действием УФ лучей, избыточному накоплению Са²⁺ в цитоплазме, запускающему мембранодеструктивные процессы, связанные с активацией гидролитических ферментов, в частности фосфолипазы А², что влечет за собой повреждение внутриклеточных структур. Повышение проницаемости для Н⁺ и ОН^- ионов приводит к разобщению окислительного фосфорилирования в митохондриях и потере ими способности аккумулировать Са²⁺, а усиление проницаемости для ионов K⁺ ведет к набуханию митохондрий и нарушению их биоэнергетических функций. Перекисное повреждение мембран лизосом является причиной повреждения внутриклеточных структур лизосомальными ферментами. Кроме того, дальнейшее накопление продуктов ПОЛ при облучении инактивирует важнейшие мембранные ферменты, такие как глюкозо-6-фосфотаза, цитохром Р-450, Са²⁺-АТФаза, моноаминоксидаза, переносчики электронов редокс-цепей митохондрий. Дефицит макроэргов и повреждение клеточных структур собственными гидролитическими ферментами еще больше увеличивает ионную проницаемость мембран клетки и вводит ее в порочный круг нарушения ионного гомеостаза и биоэнергетики, который, если его не разорвать, неумолимо ведет клетку к разрушению.

Таблица 1. Содержание первичных продуктов ПОЛ в крови крыс при УФО на фоне применения цитофлавина и его составных компонентов (М±т)

Здесь и в табл. 2-4:
* достоверность различия показателей по сравнению с животными интактной группы (р<0,05);
** достоверность различия показателей по сравнению с контрольной группой животных, к которым применяли только воздействие УФО (р<0,05);
*** достоверность различия показателей облучаемых животных, получавших цитофлавин, по сравнению с группой облучаемых животных, получавших янтарную кислоту (р<0,05).

Таблица 2. Содержание малонового диальдегида (нмоль/мл) в крови крыс при УФО на фоне применения цитофлавина и его составных компонентов (М±т)

Проведенными ранее исследованиями показано, что оптимизировать функцию митохондрий, предотвратить разобщение окисления и фосфорилирования, увеличить энергопродукцию с последующей нормализацией энергозависимых процессов (работа ионных “помп”, синтез фосфолипидов, белка и т.д.) и повысить активность АОС можно введением экзогенного сукцината, входящего в состав комбинированного препарата цитофлавин [3]. Цитофлавин стабилизирует процессы липопероксидации в условиях УФО, что подтверждается достоверным снижением содержания продуктов ПОЛ: гидроперекисей липидов на 23 и 25% на 7 и 14 дни эксперимента соответственно, диеновых конъюгатов - на 23, 25%, малонового диальдегида - на 27 и 24% (р<0,05) (табл. 1, 2). В свою очередь, оценивая влияние компонентов цитофлавина на интенсивность накопления продуктов пероксидации в крови облучаемых животных, необходимо отметить достоверное снижение уровня гидроперекисей липидов к концу второй недели эксперимента на 16% (рибоксин) и 15% (янтарная кислота), диеновых конъюгатов - на 16% (рибоксин) и 16% (янтарная кислота) к концу второй недели опыта, малонового диальдегида - на 15% (янтарная кислота) к концу первой недели эксперимента, на 15, 14, 10% (янтарная кислота, рибоксин, никотинамид соответственно) - к концу второй недели (р<0,05). Сравнивая содержание продуктов пероксидации в крови облучаемых животных на фоне введения цитофлавина и янтарной кислоты, важно отметить, что последняя уступает комбинированному препарату в антирадикальной активности, в частности, уровень диеновых конъюгатов и малонового диальдегида в крови животных, получавших цитофлавин, был достоверно ниже аналогичных показателей в крови крыс, получавших янтарную кислоту, как на 7, так и на 14 день эксперимента (р<0,05). Таким образом, экспериментально подтвержденное более выраженное стабилизирующее влияние цитофлавина в сравнении с вводимыми составными компонентами препарата на процессы пероксидации и накопления продуктов радикального характера в крови в условиях УФО связано, по-видимому, с дополнением действия янтарной кислоты в составе цитофлавина рибофлавином, способным за счет своих коферментных свойств увеличивать активность сукцинатдегидрогеназы и обладающим непрямым антиоксидантным действием (восстановление окисленного глутатиона). Входящий в состав никотинамид активирует НАД-зависимые ферментные системы. За счет рибоксина достигается увеличение содержания общего пула пуриновых нуклеотидов, необходимых не только для ресинтеза макроэргов (АТФ и ГТФ), но и вторичных мессенджеров (цАМФ и цГМФ), а также нуклеиновых кислот [9, 10]. Определенную роль может играть способность рибоксина подавлять активность ксантиноксидазы, уменьшая тем самым продукцию высокоактивных форм и соединений кислорода. Поэтому активные компоненты цитофлавина обладают взаимопотенцирующими эффектами, являются индукторами основных метаболических путей в клетках, активаторами энергообразующих процессов, способствующих утилизации свободного кислорода, что, в конечном итоге, способствует снижению интенсивности перекисных процессов.

Данные факты были подтверждены результатами исследования активности основных компонентов АОС (табл. 3, 4), которые отразили повышение уровня церулоплазмина на фоне введения цитофлавина на 32, 37% на 7 и 14 дни эксперимента соответственно (р<0,05), витамина Е — на 33 и 34%, соответственно (р<0,05), причем учитывая достоверность полученных результатов и степень выраженности изменений показателей АОС, необходимо отметить, что препарат цитофлавин превосходит все исследуемые лекарственные средства, в том числе и янтарную кислоту (содержание церулоплазмина в группе облучаемых животных, получавших цитофлавин, было достоверно выше в сравнении с аналогичным показателем в группе животных, получавших только янтарную кислоту, уже к концу первой недели эксперимента). Оценивая влияние составных компонентов цитофлавина на содержание церулоплазмина, можно констатировать достоверное увеличение данного показателя относительно контроля на фоне введения янтарной кислоты (на 28%) и рибоксина (на 26%) к концу второй недели опыта. В эти же временные сроки уровень витамина Е достоверно превысил контроль на 26% в группе облучаемых животных, получавших никотинамид. В свою очередь, исследование активности ферментов антиоксидантной защиты на фоне применения цитофлавина позволило констатировать достоверное повышение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (на 12-14%) и каталазы (на 43-47%) (р<0,05). Важно заметить, что активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы была достоверно выше относительно показателей крыс контрольной группы в группе облучаемых животных, получавших рибофлавин (на 14% на 7 день эксперимента), и в группе крыс, получавших никотинамид (на 12% на 14 день опыта, р<0,05). Аналогичная тенденция прослеживалась в отношении каталазы к концу первой недели опыта у облучаемых крыс на фоне введения янтарной кислоты, рибофлавина, никотинамида (на 31, 33, 37% соответственно выше относительно контроля), к концу второй недели — на фоне введения янтарной кислоты и никотинамида (на 30 и 32% соответственно, р<0,05).

Таким образом, с учетом полученных результатов о динамике содержания основных компонентов АОС в сыворотке крови экспериментальных животных, можно констатировать, что антиоксидантная активность цитофлавина в условиях УФО превосходит по большинству показателей активность входящих в его состав компонентов — янтарную кислоту, рибоксин, рибофлавин и никотинамид, что свидетельствует о целесообразности применения комбинированного сукцинатсодержащего препарата цитофлавин, улучшающего окислительный метаболизм, стабилизирующего процессы липопероксидации и повышающего активность АОС при облучении.

Таблица 3. Содержание компонентов АОС в крови крыс при УФО на фоне применения цитофлавина и его составных компонентов (М±m)

Таблица 4. Содержание ферментов АОС в крови крыс при УФО на фоне применения цитофлавина и его составных компонентов (М±m)

Выводы

1. Экспериментально подтверждена антиоксидантная активность цитофлавина в условиях окислительного стресса, индуцированного воздействием УФ лучей, превосходящая по выраженности фармакологического эффекта янтарную кислоту, рибоксин, рибофлавин и никотинамид.
2. Внутрибрюшинное введение лабораторным животным цитофлавина в дозе 100 мг/кг по сукцинату (7, 14 день) в условиях УФО снижает содержание продуктов пероксидации и увеличивает активность основных компонентов АОС.

Литература

1. В. В. Афанасьев, Цитофлавин в интенсивной терапии: Пособие для врачей, Тактик-Студио, Санкт-Петербург (2005).
2. В. А. Доровских, Н. В. Симонова, Патент России № 2348079, Бюл. изобрет., № 38 (2007).
3. В. А. Доровских, Н. В. Симонова, О. Н. Ли и др., Бюл. физиол. и патол. дыхания, № 50, 56 - 60 (2013).
4. В. А. Доровских, С. С. Целуйко, Н. В. Симонова, Р. А. Анохина, В мире антиоксидантов: учебное пособие, Благовещенск (2012).
5. Р. Ж. Киселевич, С. И. Скварко, Лаб. дело, № 8, 473 - 475 (1972).
6. В. Г. Колб, В. С. Камышников, Клин. биохимия, Минск (1976).
7. Н. Д. Королюк, Л. И. Иванова, И. Г. Майорова, Лаб. дело, № 1, 16-18 (1988).
8. Е. А. Лебедева, А. А. Куртасов, М. Е. Белоусова и др., Эксперим. и клин. фармакол., 77(4), 42 - 44 (2014).
9. В. В. Никонов, А. Ю. Павленко, Медицина неотложных состояний, № 3, 22 - 23 (2009).
10. С. В. Оковитый, С. Н. Шуленин, А. В. Смирнов, Клиническая фармакология антигипоксантов и антиоксидантов, Санкт-Петербург (2005).
11. Н. В. Симонова, Аграрный науч. ж., № 8, 23 - 26 (2011).
12. Н. В. Симонова, В. А. Доровских, Н. П. Симонова, Ультрафиолетовое облучение и окислительный стресс. Возможности фитокоррекции, Благовещенск (2014).
13. Н. В. Симонова, А. П. Лашин, Н. П. Симонова, Вестник Красноярского государственного аграрного университета, №5,95-98 (2010).
14. И. Д. Стальная, Л. А. Романова, Современные методы в биохимии, Медицина, Москва (1977), сс. 64 - 65.
15. И. Д. Стальная, Современные методы в биохимии, Медицина, Москва (1977), сс. 63 - 64.
16. И. Д. Стальная, Т. Г. Гаришвили, Современные методы в биохимии, Медицина, Москва (1977), сс. 66 - 68.

Comparative effectiveness of cytoflavin and its constituent components in experimental oxidative stress

V. A. Dorovskikh, N. V. Simonova, D. I. Pereverzev, and M. A. Shtarberg
Amur State Medical Academy, ul. Gorkogo 95, Blagoveshchensk, 675000 Russia

The search and development of methods for correction of oxidative stress under conditions of exposure to adverse environmental factors is a topical problem in modern medicine. We have studied the possibility to correct free-radical oxidation of lipids in rat organism membranes in experiments with the introduction of cytoflavin. It is established that daily ultraviolet (UV) irradiation for 3 min leads to an increase in the level of lipid hydroperoxides, diene conjugates, and malo- nic dialdehyde on the background of decrease in activity of the antioxidant system of blood in experimental animals. The introduction of cytoflavin (100 mg/kg, i.p.) for 14 days immediately prior to IV irradiation leads to reliable (p<0.05) decreases the blood level of lipid hydroperoxides (by 23 - 25%), diene conjugates (by 23 - 25%), and malonic dialdehyde (by 24 - 27%) in comparison to rats in the control group. Analysis of the effect of cytoflavin on activity of the antioxidant system components showed that the levels of ceruloplasmin and vitamin E in the blood of animals was reliably (p<0.05) higher by 32 - 37% than analogous indicator in rats of the control group. Thus, the administration of cytoflavin under conditions of oxidative stress leads to stabilization of the process of lipid peroxidation in the organism of animals on the background of increased activity of main components of the blood antioxidant system.
Keywords: cytoflavin; oxidative stress; ultraviolet radiation; biological membranes; lipid peroxidation; peroxidation products; lipid hydroperoxides; diene conjugates; malonic dialdehyde; antioxidant system; rats.

Комментарии