Методы исследования больных хроническим урогенитальным хламидиозом

Опубликовано в:
УРОГЕНИТАЛЬНЫИ ХЛАМИДИОЗ
Иркутск, 2007

2.1. Клинические методы исследования

Сбор анамнеза заболевания должен сопровождаться подробной детализацией жалоб, при этом уточняются возможные сроки инфицирования. Учитываются ранее перенесенные УГИ, используемые диагностические методики и лекарственные препараты, а также результаты контрольных обследований. Кроме того, у каждого больного выясняется наличие аллергических реакций к лекарственным препаратам.

Обследование больных начинается с общего осмотра, который в том числе имеет цель исключения выраженной экстрагенитальной патологии, нередко осложняющей течение хронического УГХ. Специальное обследование на наличие ИППП проводится при условии, что больной не мочился в течение 3-4 часов. Производится осмотр и пальпация полового члена, органов мошонки, при этом отмечается правильное или аномальное их развитие. При оценке состояния наружного отверстия уретры обращают внимание на наличие гиперемии, отечности, склеивания губок. Визуальная оценка отделяемого из уретры позволяет определить их количество (обильные, скудные), цвет и характер (гнойные, слизистые, слизисто-гнойные). Кроме того, производится осмотр области заднего прохода, пальпация лимфатических сосудов на спинке полового члена и паховых лимфатических узлов. Состояние органов мошонки оценивается по визуальному осмотру кожного покрова, пальпации, при которой определялись форма, величина, консистенция, подвижность яичек и их придатков, а также наличие выпота в оболочке, участков уплотнений или размягчений. При прощупывании семенного канатика обращают внимание на инфильтраты, скопление жидкости и расширенные венозные сосуды.

Для визуальной оценки вовлеченности в патологический процесс передней и задней уретры и половых желез используется двухстаканная проба Томпсона. Однако при отсутствии или скудном отделяемом из уретры, что характерно для УГХ, она была недостаточно информативна.

С целью диагностики осложнений со стороны добавочных половых желез у всех пациентов необходимо проводить пальцевое трансректальное исследование ПЖ, семенных пузырьков и бульбоуретральных желез с изучением полученных секретов. Диагностический массаж выполняется после мочеиспускания, в коленно-локтевом положении. Пальпация ПЖ позволяет определить ее размеры, форму, характер и однородность консистенции, состояние поверхности, выраженность срединной бороздки, четкость границ и степень болезненности (Арнольди Э. К., 1999). Кроме того, при ректальном пальцевом исследовании иногда удается пальпировать семенные пузырьки, что является возможным признаком их воспаления (Ильин И. И., 1991; Молочков В. А., Ильин И. И., 1998). Помимо перечисленных, топическая диагностика у мужчин осуществляется с использованием уретроскопического и ультразвукового методов исследования.

2.2. Лабораторные методы исследования

С 70-х годов прошлого века для изучения биологии хламидий была предложена методика выделения их в культуре клеток, что послужило началом нового периода изучения хламидийной инфекции (Шинский Г. Э. и др., 1999). К сожалению, следует отметить, что в настоящее время нет ни одного метода, используемого для идентификации хламидийной инфекции, дающего 100%-ное определение возбудителя (Соколовский Е. В. и др., 2002).

Культуральный метод (среда McCoy Hela и др.) обладает высокой чувствительностью и специфичностью, однако имеет ряд недостатков: трудоемкость, длительность (около 4-7 дней), отмечаются проблемы с воспроизводимостью, наличие дорогостоящего оборудования, сред, инструментария, посуды, высококвалифицированного персонала, поэтому в практике используется относительно редко.

Самый распространенный метод диагностики УГХ — иммунопатологический метод люминесцирующих антител (ПИФ и НИФ). При люминесцентной микроскопии мазков антигены хламидии выявляются на красном или оранжевом фоне цитоплазмы эпителиальных клеток или на темном фоне препарата в виде единичных ярко-зеленых ЭТ и РТ.

Иммуноферментный анализ (ИФА), учитывая низкую иммуногенность урогенитальных штаммов хламидии, а также вероятность присутствия антител в результате ранее перенесенной инфекции, используется в динамике заболевания с учетом титра антител.

Основным диагностическим методом в рутинной практике, позволяющим проводить адекватное выявление С. trachomatis, при всех известных вариантах течения УГХ может быть признана ДНК-диагностика и ее наиболее часто используемая в России модификация ПЦР (Куляш Г. Ю., 2003; Федотов В. П. и др., 2005; Wiesenfeld H. et al, 1994; Stary A., 2000; Hosseinzadeh S. et al., 2003; Martin D. H. et al, 2004; Vats V. et al., 2004).

Для выявления персистирующих форм хламидии может использоваться метод электронной микроскопии (при этом можно обнаружить гигантские РТ с расширенным периплазматическим пространством, а также деление перипласта РТ и отшнуровку мелких шаровидных форм в периплазматическом пространстве). Оптимальным вариантом диагностики УГХ считается использование как минимум двух (по мнению некоторых авторов, трех) методик, одна из которых ПЦР (Глазкова Л. К., Акилов О. Е., 1999; Хрянин А. А., 2001; Иванов О. Л. и др., 2002). К сожалению, следует отметить, что в настоящее время нет ни одного метода, используемого для идентификации хламидийной инфекции, дающего 100%-ное определение возбудителя.

Комплексное обследование проводится всем больным в момент первичного обращения в клинику и в динамике спустя 3-4 недели (лучше 2 месяца) после окончания лечения.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Обследование на ИППП проводилось в соответствии с Методическими материалами (1998-2003 гг.) и действующими приказами МЗ России на базе клиник ГОУ ВПО ИГМУ и микробиологического отдела ЦНИЛ ИГМУ. ПЦР-диагностика проводилась на базе Иркутского городского Центра молекулярной диагностики. Культуральное исследование микрофлоры уретры проводилось в бактериологической лаборатории клиник ГОУ ВПО ИГМУ.

Все больные проходили обязательное серологическое обследование на сифилис и наличие антител к ВИЧ методом ИФА.

Метод световой микроскопии использовался для выявления интенсивности воспалительного процесса и исключения других ИППП. Материалом служили отделяемое уретры, центрифугат первой порции мочи и секрет простаты. Исследование проводилось в нативных препаратах и при микроскопии препаратов, окрашенных метиленовым синим, по Граму и Романовскому-Гимзе. Диагноз уретрита считался микроскопически подтвержденным, если в исследуемом мазке присутствовало более 5 лейкоцитов в поле зрения (Fleming D., Rodgers С. А., 2004).

Перед диагностическим ректальным массажем предстательной железы больной опорожнял мочевой пузырь. Полученный в результате массажа секрет использовался для проведения микроскопического и иммунологического исследований. При микроскопии нативного препарата в секрете определялось наличие лейкоцитов, эритроцитов, лецитиновых зерен, амилоидных телец, эпителиальных клеток. Присутствие в секрете более 10 лейкоцитов в поле зрения расценивалось как признак воспаления в предстательной железе (Ильин И. И., 1991; Молочков В. А., Ильин И. И., 1998). Количество лецитиновых зерен являлось критерием оценки функциональной активности железы (Кульчавеня Е. В. и др., 2001).

Метод прямой иммунофлюоресценции с моноклональными антителами против главного белка наружной мембраны (МОМР) применялся для обнаружения антигенов С. trachomatis. В исследовании использовались коммерческие наборы «ХлаМоноСкрин» («Ниармедик», Россия).

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) использовалась для выявления антигенов С. trachomatis в эпителиальных клетках. Для проведения исследования методом ПЦР применялся амплификатор Perkin Elmer (USA) и отечественные диагностические наборы ООО «Литех» и «Клинбиотех».

2.3. Иммунологические методы исследования

Исследование общего иммунного статуса проводилось на базе иммунологического отдела ЦНИЛ ИГМУ

С помощью унифицированных стандартных тестов 1-го и 2-го уровней (Петров Р. В. и др., 1984), разработанных Институтом иммунологии МЗ РФ (Москва), в соответствии с рекомендациями ВОЗ проводилась оценка иммунного статуса.

Содержание в периферической крови лейкоцитов определялось путем подсчета форменных элементов в счетной камере Горяева. Количество лимфоцитов, эозинофилов, базофилов, нейтрофилов и моноцитов считалось при микроскопическом исследовании мазка, окрашенного по Романовскому-Гимзе.

Относительное и абсолютное количество субпопуляций лимфоцитов определялось на основании их электрофоретической подвижности методом клеточного электрофореза в жидкой фазе с помощью измерительного прибора «Пармоквант-2» (Карл Цейс Йена, Германия) в объективном автоматическом режиме. При этом в каждом исследовании обсчету подвергалось 100 клеток, после чего средняя электрофоретическая подвижность лимфоцитов автоматически отображалась в виде графика. Первый пик на графике составляли преимущественно В-лимфоциты, второй соответствовал Т-лимфоцитам. Количество Т-супрессоров определялось числом среднеподвижных клеток, составляющих 4 шага прибора, следующих за первым пиком В-лимфоцитов. Остальные, высокоподвижные, клетки считались Т-хелперами, занимавшими место до конца цитоферограммы. Расчет абсолютного количества субпопуляций лимфоцитов в периферической крови проводился исходя из их процентного соотношения и лейкограммы. С учетом значения лейкоцитарной формулы рассчитывалось абсолютное количество общих лимфоцитов:

После этого на основании относительного количества субпопуляций лимфоцитов проводился расчет их абсолютного содержания:

С помощью метода радиальной иммунодиффузии в агаровом геле по Манчини в модификации Р. Г. Скворцовой и соавт. (1989) определялись иммуноглобулины классов А, М, G. Использовались соответствующие моноспецифические сыворотки, приготовленные в Институте эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи.

По отношению к культуре Staphylococcus aureus штамма 209 определялась фагоцитарная активность нейтрофилов с помощью теста незавершенного фагоцитоза. При этом поглотительная способность фагоцитов оценивалась по следующим показателям:
процент фагоцитоза — процент фагоцитировавших клеток из числа сосчитанных нейтрофилов;
фагоцитарное число — среднее число бактерий, находящихся внутриклеточно; рассчитывалось как частное от деления общего числа поглощенных бактерий на число лейкоцитов, вступивших в фагоцитоз;
фагоцитарный индекс — среднее число микробов, поглощенных одним активным нейтрофилом.

Метаболическая активность нейтрофилов оценивалась в спонтанном тесте с нитросиним тетразолием по методике М. Е. Виксмана и А. Н. Маянского (1979). При микроскопическом исследовании мазков в каждом из них подсчитывалось 100 нейтрофилов, среди которых определялся процент клеток, содержащих отложения диформализированных гранул (НСТ-позитивных нейтрофилов).

Исследование локального иммунного статуса проводилось на базе ЦНИЛ Иркутского государственного института усовершенствования врачей.

Для количественного определения в секрете предстательной железы IFN-y, IgA, IgG и подклассов IgGl, IgG2, IgG3 применялся метод ИФА с использованием соответствующих коммерческих наборов ИФА-БЕСТ производства ЗАО «Вектор-Бест» (г. Новосибирск).

Основным реагентом набора для определения IFN-y являются моноклональные антитела (МКАТ) к этому цитокину, сорбированные на поверхности лунок разборного полистирольного планшета. Исследуемые пробы инкубировались последовательно с иммобилизованными антителами и двумя специальными конъюгатами (антитела к IFN-y человека с биотином и стрептавидин с пероксидазой хрена), при этом не связавшийся материал периодически удалялся отмывкой. По окончании всех манипуляций измерялась оптическая плотность полученных растворов в лунках при длине волны 450 нм. Интенсивность желтого окрашивания была пропорциональна количеству содержащегося в образце IFN-y.

Определение общих IgA, IgG и подклассов IgGl, IgG2, IgG3 осуществлялось с применением твердофазного метода иммуноанализа, который основан на принципе «сэндвича». Анализ проводился в две стадии. На первой стадии калибровочные пробы с известными концентрациями соответствующих иммуноглобулинов и исследуемые образцы инкубировались в лунках планшета с иммобилизованными МКАТ к этим иммуноглобулинам. После отмывки, на второй стадии, связавшиеся иммуноглобулины обрабатывались конъюгатом МКАТ с пероксидазой с последующей отмывкой. Образовавшиеся иммунные комплексы «иммобилизованные MKAT-Ig-конъюгат» выявлялись ферментативной реакцией пероксидазы с перекисью водорода в присутствии хромогена (тетраметилбензидина или ортофенилендиамина). Интенсивность окраски хромогена была пропорциональна концентрации соответствующего иммуноглобулина в анализируемом образце. После остановки пероксидазной реакции стоп-реагентом результаты учитывались фотометрически. Концентрация иммуноглобулина определялась по соответствующему калибровочному графику.

Ультразвуковое исследование предстательной железы проводилось на аппарате Aloka SSD-500 с использованием трансректального датчика (7,5 мГц).

2.4. Методы этиотропной и патогенетической терапии

Для лечения больных с хроническим УГХ использовались этиотропные и патогенетические препараты, механизм действия которых направлен на элиминацию возбудителя, санацию предстательной железы и уретры, предотвращение развития постхламидийных уретритов.

Учитывая хроническое течение УГХ, а также наличие осложнения в виде простатита, вильпрафен данной категории больных назначался по 500 мг 2 раза в день в течение 14 дней (Якубович А. И. и др., 2001; Шабалин А. Р. и др., 2004).

Все больные получали циклоферон внутримышечно по 2 мл (250 мг) один раз в сутки на 1, 2, 4, 6, 8,10, 12, 14, 16, 19-й день курса лечения.

В основной группе больных дополнительно использовался 5% линимент циклоферона эндоуретрально. С помощью канюли или эластического уретрального катетера, в зависимости от уровня поражения, линимент циклоферона вводился в уретру на 1-3 минуты в объеме 5 мл, после чего оставшийся объем эвакуировался самотеком. Через 30 минут больному было рекомендовано помочиться, так как более длительная экспозиция препарата могла привести к отеку слизистой уретры. Инстилляции проводились 1 раз в день от 7 до 10 процедур на курс лечения. Антибактериальная терапия подключалась после 2-4 инстилляции и инъекций циклоферона.

Группа сравнения была пролечена с использованием вильпрафена и инъекций циклоферона без применения местного лечения.

Эффективность терапии оценивалась по критериям: выздоровление — полное разрешение субъективных и объективных клинических симптомов и элиминация возбудителя; улучшение — значительное уменьшение клинической симптоматики при положительных анализах на С. trachomatis; отсутствие эффекта — сохранение или увеличение клинических симптомов и отсутствие динамики в лабораторных показателях; рецидив — повторное проявление клинических симптомов УГХ с лабораторным подтверждением наличия возбудителя в течение 3 месяцев после окончания лечения при отсутствии повторного инфицирования.

2.5. Методы статистической обработки полученных результатов

Данные, полученные в результате исследования, были подвергнуты статистической обработке на персональном компьютере Pentium-4 с помощью статистической программы Primer of Biostatistic Version 4.03. Различия исследуемых показателей до и после лечения оценивались с использованием парного критерия Стьюдента, в множественных сравнениях — с использованием поправки Бонферрони. Различия считались достоверными при Р РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для исследования были отобраны 150 мужчин, обратившихся в кабинет анонимного обследования и лечения урогенитальных инфекций клиник ГОУ ВПО «Иркутский государственный медицинский университет».

Мужчины, отобранные для участия в исследовании, были наиболее трудоспособного и сексуально активного детородного возраста. По возрасту больные распределились следующим образом: от 21 года до 30 лет — 59% больных, от 31 года до 40 лет — 41% больных.

Анализ социального положения больных показал, что практически равные доли в исследуемых группах составили служащие — 22%, рабочие — 21%, лица, формально числящиеся как неработающие — 21% и предприниматели — 20%. Несколько реже обращались студенты — 10% и военнослужащие — 6%.

У 100 мужчин был диагностирован хронический УГХ, подтвержденный двумя методами — ПИФ и ПЦР, с длительностью заболевания свыше полугода. Из анамнеза удалось выяснить, что давность заболевания у 43% больных составляла от 0,5 года до 3 лет. Остальные 57% больных имели длительность заболевания более 3 лет или не смогли определить реальные сроки инфицирования.

При опросе больных выявлено, что все пациенты, у которых был диагностирован хронический УГХ, имеют одного полового партнера и не вступают в случайные половые связи. Ранее перенесенные ИППП: у 54 больных в анамнезе присутствовала трихомонадная инфекция, у 25 больных прежде выявлялась хламидийная инфекция, у 14 больных — гонорея, у 11 больных — уреа- и микоплазмоз, у 1 больного — сифилис.

Критерием отбора было отсутствие других ИППП (ВИЧ-инфекция, сифилис, гонорея, трихомониаз). Из исследования были исключены больные, у которых в анамнезе отмечалась непереносимость используемых препаратов, имеющие выраженную патологию щитовидной железы, почек, печени и желудочно-кишечного тракта, принимавшие за месяц до обращения антибактериальные препараты и/или в течение ближайших 6 месяцев иммуномодуляторы.

У всех больных патологический процесс локализовался в мочеполовой системе, клинических проявлений и жалоб со стороны других органов и систем выявлено не было.

Всем больным ранее уже проводилась безуспешная терапия по поводу УГХ и его осложнений, включавшая в себя в комплексном лечении антибактериальные препараты из группы макролидов, тетрациклинов и фторхинолонов. Больным хроническим УГХ было рекомендовано воздержаться от незащищенных половых контактов во время лечения и до последующего контроля с целью исключения повторного инфицирования.

Контроль излеченности проводился также с использованием двух методов — ПИФ и ПЦР. Исследование на наличие С. trachomatis проводилось не ранее 2 месяцев после завершения лечения в связи с имеющимися сведениями о возможном выявлении хламидийной ДНК в течение 8 недель после окончания курса терапии.

2.6. Дизайн исследования

С целью оценки состояния общего и местного иммунного статуса всем 150 мужчинам было проведено иммунологическое исследование периферической крови и секрета предстательной железы.

Для оценки клинической и этиологической эффективности лечения проведено проспективное сравнительное контролируемое исследование.

Больные хроническим УГХ были рандомизированы методом компьютерной случайной выборки на группы, при этом пациенты были сопоставимы между собой как по возрастному составу, так и по клинической картине, течению заболевания, наличию осложнений (простатит) и сексуальной ориентации.

В 1-й группе (основной), состоявшей из 50 больных, в состав комплексной терапии входил противохламидийный антибиотик (вильпра-фен) в сочетании с внутримышечным и эндоуретральным введением циклоферона.

Во 2-й группе (сравнения), состоявшей из 50 больных, вильпрафен применялся одновременно с внутримышечными инъекциями циклоферона. Местное лечение этой группе больных не проводилось.

Контрольная группа состояла из 50 здоровых мужчин, обратившихся с целью профилактического осмотра. Мужчины из этой группы характеризовались отсутствием субъективных и объективных клинических проявлений, в результате комплексного лабораторного исследования у них не обнаружены возбудители ИППП. Отсутствие воспалительного процесса в УГТ подтверждалось данными ТРУЗИ и микроскопического исследования, при котором количество лейкоцитов в мазке из уретры не превышало 4 в поле зрения и 10 в секрете предстательной железы. Кроме того, мужчины, вошедшие в эту группу, отрицали аногенитальные контакты и имели постоянного полового партнера.

УРОГЕНИТАЛЬНЫИ ХЛАМИДИОЗ
Иркутск, 2007

Комментарии