Изучение протективной активности и механизма действия Циклоферона в клеточной культуре и при экспериментальной летальной гриппозной инфекции у белых м: Материалы и методы

2.1. Препараты.

2.2. Вирусы.

2.3. Животные.

2.4. Экспериментальная гриппозная инфекция

2.5. Титрование вируса в легочной ткани.

2.6. Гистологический анализ

2.7. Электронно-микроскопические исследования

2.1. Препараты. В работе использовали препарат Циклоферон в виде 12,5% водного раствора. Аликвоты препарата разводили в среде для клеточных культур Игла МЕМ (БиолоТ, Санкт-Петербург, кат.# 1.3.3). Из полученного раствора были приготовлены необходимые разведения на среде МЕМ для экспериментов на животных и в культуре клеток.

В качестве референс- препаратов использовали Ремантадин (1-(1-адамантил)- аминоэтил гидрохлорид, Aldrich Chem. Co., Milw.,WI, cat. #39.059-3) и Тамифлю (Этил (3R,4R,5S)-4-ацетамидо-5-амино-3-(1-этилпропокси)-1-циклогексен-1-карбоксилат фосфат, Hoffmann LaRoche, Швейцария).

Вирусы пассировали в аллантоисной полости 10-12 дневных куриных эмбрионов в течение 48 часов при 36^°С.

2.3. Животные. Белых беспородных мышей (самки) массой 14-16 г получали из питомника «Рапполово» (Ленинградская обл.) и содержали на стандартном рационе в регламентированных условиях вивария НИИ гриппа РАМН. Подбор животных в группы опыта проводили методом случайной выборки. До начала испытаний животные находились под наблюдением 2 недели.

Для заражения животных была использована вируссодержащая аллантоисная жидкость куриных эмбрионов. Из нее готовили серию 10-кратных разведений на физиологическом растворе, после чего инфекционная активность вируса в заражающем материале была определена в отдельном эксперименте при помощи титрования по летальности на животных. Титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча (Am.J.Hyg.,1938,27:493-497).

Исследуемые препараты вводили животным внутрибрюшинно в объеме 0,2 мл в следующих дозах: Циклоферон - 120 мг/кг, Ремантадин - 50 мг/кг, Тамифлю - 20 мг/кг веса животных. Препараты вводили по лечебно-профилактической схеме: за 24 часа и 1 час до заражения и через 24, 48 и 72 часа после заражения. В качестве плацебо контрольной группе животных вводили физиологический фосфатный буфер. В качестве отрицательного контроля использовали интактных животных, которые содержались в тех же условиях, что и опытные группы.

Вирусы вводили животным интраназально под легким эфирным наркозом в дозе 1 и 5 LD₅₀. В каждую группу наблюдения брали по 25 мышей. На 3 день после заражения 10 животных из каждой группы умерщвляли, вскрывали и изолировали легкие. Из этих 10 легких 5 использовали для выделения вируса (замораживали и хранили при -20^°С до постановки соответствующих экспериментов), оставшиеся 5 фиксировали 10% забуференным формалином и использовали для гистологического анализа (см. ниже).

Наблюдение за оставшимися животными осуществляли в течение 14 дней, т.е. срока, в течение которого при экспериментальном гриппе отмечается смертность животных. Ежедневно фиксировали смертность животных в контрольных и опытных группах. На основании полученных показателей смертности в каждой группе рассчитывали процент смертности (M, отношение числа павших за 14 дней животных к общему числу зараженных животных в группе), индекс защиты (IP, отношение разницы процентов смертности в контрольной и опытной группах к проценту смертности в контрольной группе) и среднюю продолжительность жизни животных (DL) из расчета 14 дней наблюдения в соответствии со следующими формулами:

2.5. Титрование вируса в легочной ткани.

Для определения инфекционного титра вируса гриппа в легочной ткани животных легкие мышей, извлеченные на 3 сутки после инфицирования гомогенизировали в десятикратном объеме стерильного физиологического фосфатного буфера и готовили из гомогенатов серию десятикратных разведений на том же буфере. При определении титра вируса гриппа использовали культуру клеток MDCK, выращенных на 96 луночных панелях на среде МЕМ. Клетки заражали серийными десятикратными разведениями легочного гомогената от 10⁰ до 10^-6 и инкубировали в термостате в течение 48 часов. По окончании срока инкубации культуральную жидкость переносили в лунки планшета для иммунологических реакций, после чего добавляли равный объем 1% куриных эритроцитов физиологическом растворе.

Уровень репродукции вируса в лунках панели оценивали по реакции гемагглютинации (РГА) эритроцитов. За титр вируса принимали величину, противоположную десятичному логарифму наибольшего разведения вируса, способного вызвать положительную реакцию гемагглютинации и выражали в логарифмах 50% экспериментальной инфекционной дозы вируса (lg ЭИД₅₀).

2.6. Гистологический анализ. Для морфологического исследования легкие фиксировали 10 % формалином, заливали в парафин и готовили из полученных блоков срезы толщиной 4 мкм. Срезы освобождали от парафина ксилолом, регидратировали в этаноле убывающей концентрации, окрашивали гематоксилин- эозином и заключали в бальзам. Препараты исследовали под световым микроскопом. Оценивали интенсивность и клеточный состав воспалительного инфильтрата в очагах пневмонии, а также степень дегенеративных и пролиферативных процессов в ткани легких.

2.7. Электронно-микроскопические исследования. Клетки MDCK, выращенные в 24-луночных планшетах, обрабатывали Циклофероном за 1 час до заражения вирусом гриппа A/swine/1976/31 (H1N1) в дозе 10⁴ CTD₅₀/0,2 mL. Через 8 и 24 часа после заражения контрольные и опытные клетки культуры фиксировали 1,5% раствором глутаральдегида на среде DMEM (рН 7,2), центрифугировали 20 мин при 2000 об./мин и фиксировали 2,5% раствором OsO₄Клетки обезвоживали ацетоном в возрастающей концентрации и заливали в смесь эпон/аралдит. Ультратонкие срезы, полученные на ультрамикротоме Ultracut (Reichert, Austria), контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца и просматривали на электронном микроскопе JEM-100S (JEOL, Japan) при инструментальном увеличении 5000 - 50000. Фотосъемку производили на пленку ФТ-41МД.

Исследование клеточного состава и морфологии вирионов гриппа в бронхолегочных смывах животных. Для изучения влияния Циклоферона на морфогенез гриппозной инфекции in vivo животных инфицировали вирусом гриппа A/swine/1976/31 (H1N1) в дозе 10-100 LD₅₀. Животным опытной группы дважды в сутки по лечебно- профилактической схеме (см. выше) вводили Циклоферон из расчета 120 мг/кг/сут. Животные контрольной группы получали инъекции физиологического раствора. На 3 сутки после инфицирования животных забивали и готовили бронхолегочные смывы, вводя через трахею 1 мл физиологического фосфатного буфера. Клеточную фракцию осаждали центрифугированием 15 мин при 2500 об./мин, ресуспендировали в 100 мкл физиологического раствора и наносили в виде мазка на предметные стекла. Мазки окрашивали краской Гимза и исследовали под световым микроскопом.

Вирус гриппа из надосадка бронхолегочных смывов концентрировали при помощи ультрацентрифугирования при 20 000 об./мин в течение 1 часа в роторе SW.50-1 (Beckman), ресуспендировали в 50 мкл физиологического раствора, сорбировали на Медную сетку с углеродной подложкой в течение 15-20 сек, затем подложку отмывали дистиллированной водой и контрастировали 1,5% раствором натриевой соли фосфовольфрамовой кислоты (ФВК) (рН 7,1). Препарат высушивали при комнатной температуре и исследовали с помощью электронного микроскопа JEM-100S (JEOL, Япония).

Далее: 3. Результаты исследования

Комментарии