Зависимость выраженности дезагрегационых эффектов дибикора от его плазменных концентраций у больных сахарным диабетом типа 2

Опубликовано в:

«ВЕСТНИК ВОЛГМУ» »» 2008 Выпуск № 1 (25)

Н.Б. Рогова, А.А. Бочарников
Волгоградский Гэсударственный Медицинский Университет, кафедра клинической фармакологии

Ключевые слова: агрегация тромбоцитов, малоугловое светорассеяние, дибикор, АДФ.

N. V. Rogova, A. A. Bocharnikov
Volgograd State Medical University; chair of Clinical Pharmacology

Correlation between intensity of desegregations effect of dibicor and its plasma concentration in patient's with diabetes mellitus was studied using the method of low-angle light scattering on «Light-Scan». The method produced accurate and repeatable results.

Keywords: platelet aggregation, low-angle light detection, ADP, dibicor

В Росси смертность от сердечно-сосудистых заболеваний составляет ~ 56,4 % от общего количества смертей. Ежегодно ~ 20 млн. случаев заболеваний в мире связаны с патологией сердечно-сосудистой системы, каждый 4-й со смертельным исходом. С такими темпами к 2020 году численность больных увеличиться до 7,6 млн в год. Наибольшая частота встречаемости летальных исходов от сердечно-сосудистых заболеваний отмечена среди больных сахарным диабетом в Китае, Восточной Европе, России. В России ежегодно насчитывается - 0,5 млн человек страдающих сердечно-сосудистыми заболеваниями, из них только 1/5 к нормальной жизнедеятельности, остальные - инвалидизация или смерть (многоцентровое исследование «PROGRESS» 2001 г).

Сахароснижающие средства в той или иной степени выраженности обладают эффектами улучшающими гемореологию. В последние годы широко применяется дибикор в терапии сахарного диабета типа 2.

В связи с тяжелыми сердечно-сосудистыми осложнениями сахарного диабета типа 2, возникает необходимость контроля реологических свойств крови. Существуют различные методы и методики контроля параметров реологических свойств крови. Например такие как:

• регистрация параметров реологических свойств крови при помощи ротационного вискозиметра АКР-2 при скоростях сдвига от 300 с^-1 до 3 с^-1, моделирующих интенсивность кровотока в сосудах разного калибра;
• агрегацию тромбоцитов и влияние на неё препаратов изучают на двухканальном лазерном анализаторе агрегации тромбоцитов фирмы «Solar», «Биола», с индуктором агрегации динатриевой солью аденозин-5-дифосфорной кислоты (АДФ). Оценку спонтанной и индуцированной агрегации тромбоцитов проводят по кривым относительного среднего радиуса агрегатов с вычислением степени и скорости агрегации;
• агрегационная активность тромбоцитов анализируется на агрегометре «Трамлайт». Возможна оценка показателей: время достижения максимальной агрегации, степень агрегации и дезагрегации;
• агрегацию тромбоцитов проводят на приборе «Лайт-Скан», регистрируя малоугловое светорассеяние. Возможна оценка параметров: время достижения максимальной агрегации, - степень агрегации и дезагрегации, степень активации тромбоцитов (стадия сферизации и образование псевдоподий).

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Оценить влияние фармакокинетики дибикора на выраженность его дезагрегационых эффектов с помощью адаптированной методики регистрации активации и агрегации тромбоцитов человека (разработанную Э.Ф. Дергачевым и др.[4]).

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследование было включено 16 пациентов с сахарным диабетом типа 2, средней степени тяжести в состоянии субкомпенсации углеводного обмена. До включения в исследование «отмывочный период» составил 5 Т½. До и после лечения проводилось исследование реологических свойств крови.

Всем пациентам назначался дибикор по 500 мг 2 раза в день на 14 дней. Затем хроматографически определяли концентрации дибикора [хроматограф модели «HPLC-IOAvp» (Shimadzu Co., Ltd., Kyoto, Japan), оборудованный диодно-матричным детектором SPD-МЮА (Shimadzu Co., Ltd., Japan) и инжектором «Rheodyne модели 7725»; с петлей ввода на 20 мкл (Rheodyne, Cotati, СА 94928), хроматографическая колонка «SupelcoSil LC-8» (7,5 см х 4,6 мм со средним размером частиц 3 мкм)] и реологические свойства крови.

До начала исследования нами была разработана методика определения реологических свойств крови на аппарате «Лайт-Скан».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

За основу была взята модификация методики Э.Ф. Дергачева и др. [4], использующаяся в экспериментах на животных на кафедре фармакологии ВолГМУ [1]. При воспроизведении данной методики у людей были получены следующие результаты приведенные на рис. 1:

Рис. 1. Агреготограмма при рН 9,0

Картины агрегации не наблюдалось, это мы связали с тем, что необходимо более точно подобрать среду (буфер). рН получаемого буфера составлял 8,9-9,2. Согласно литературным данным скорость агрегации максимальна при рН среды 7,8, и уменьшается при закислении среды. При рН 6,0 агрегация отсутствует [2]. Поэтому рН буфера довели до 7,8 0,1 М раствором НС1.

После преобразований видно, что агрегация проходит спонтанно. Это можно связать с тем, что кровь активировалась уже в шприце после прохождения через иглу, плюс воздействие отрицательного давления под поршнем. Поэтому приняли решение о необходимости забора крови самотеком, предварительно наполнив иглу раствором цитрата натрия. Первые 2-3 капли крови собирали в отдельную пробирку, так как кровь при первом прохождении через иглу может активироваться клетками тканевых покровов. Затем брали другую пробирку с 0,5 мл цитрата натрия и набирали кровь до отметки 5 мл. Активацию плазмы до эксперимента мы связали с наличием загрязнений на внутренней поверхности пробирок, а так же наличия мелких царапин. Пробирки должны быть максимально чистыми и абсолютно с ровными и гладкими поверхностями.

После соблюдения этих условий мы получили агрегатограмму без спонтанной агрегации. Однако при добавлении АДФ мы не видели стадии активации тромбоцитов, а сразу шла стадия агрегации. Мы предположили, что наличие Са в среде ускоряет агрегацию и мы не видим стадии активации. Поэтому был приготовлен буферный раствор с ЭДТА и без Са²⁺. Получили акгиваци, но при последующем добавлениии в эту среду ионов Са²⁺ в физиологической концентрации агрегации не наблюдали, что связано с переходом тромбоцитов в рефрактерное состояние [2]. Для решения этой задачи необходимо в экспериментах использовать два буферных раствора: с Са²⁺ и без Са²⁺.

Чтобы определить концентрацию АДФ, которая вызывает максимальную агрегацию тромбоцитов в кальциевой среде, мы титровали раствор АДФ. По литературным данным на поверхности тромбоцитов имеется 3 подтипа Р2-рецепторов: Р2Х1-, Р2У1-И Р2У12-рецепторы[6]. Для прохождения агрегации необходима активация Р2У12-рецепторов. Последовательность действия АДФ на Р2-рецепторы тромбоцитов располагается в следующем порядке: ЕС50Р2Х1<EC50P2YK<<ЕС50Р2У12[2].

Проведена количественная оценка действия пуринов на процессы активации и агрегации тромбоцитов крысы и кролика методом малоуглового светорассеяния [2]. Получены значения ЕС50 АДФ, вызывающие активацию и агрегацию и отражающие последовательность действия агониста на Р2ХЬрецепторы (20-40 нМ), Р2У1-рецепторы (90-110 нМ) и Р2У12-рецепторы (120-240 нМ) [2]. Так как для прохождения агрегации необходима активация Р2У12-рецепторов, то растворы АДФ титровали от 100 до 400 нМ. Данные экспериментов отражены на рис. 2. Оптимальное количество АДФ ~ 200 нМ.

Рис. 2. Титры растворов АДФ

С помощью разработанной методики у всех пациентов были определены параметры, позволяющие характеризовать гемореологические свойства крови (до и после курсовой терапии дибикором).

После курсовой терапии наблюдали улучшение реологических свойств крови. Данные представлены в таблице.

Хроматографическое определение концентрации дибикора в крови показало наличие линейной зависимости между концентрацией дибикора и выраженностью дезагрегационного эффекта.

Кроме того, у всех пациентов на терапии дибикором достигнута компенсация углеводного обмена.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Подобранны оптимальные условия проведения агрегации и активации плазмы, индуцированную АДФ, на приборе «Лайт-Скан». Для регистрации активации: солевая среда (140 mM NaCI, рН 7,8 Трис-буфер, ЭДТА - 5тМ, при концентрации тромбоцитов около 106 кп/ мл.), АДФ 200 нМ - оценивается изменением величины прироста сигнала (А) в I¹². В солевой среде (140 mM NaCI, рН 7,8 Трис-буфер, [Са²⁺] - 1тМ, при концентрации тромбоцитов около 106 кл/мл.) агрегация, регистрируемая по светорассеянию в I² градусном угле, носит однофазный характер. Такой вид кривой (рис.3) дает возможность характеризовать агрегацию углом наклона между этой кривой (V_n) и начальной скоростью агрегации (V₀). Чем острее этот угол, тем хуже агрегация.

Рис. 3. Агреготрграмма при АДФ 200нм

Метод позволяет мониторировать реологические свойства крови при различных патологических состояниях. Мы будем использовать данную методику в нашей дальнейшей работе по изучению реологических свойств крови у больных сахарным диабетом типа 2, у которых особенно высок риск смертности от сосудистых осложнений.

Проведенное исследование показало, что используемый в терапии сахарного диабета дибикор обладает выраженной дезагрегационной эффективностью.

Установлена линейная зависимость между концентрацией дибикора и выраженностью его дезагрегационного эффекта.

Список использованной литературы

1. Деркачев Э.Ф., Миндукшее И.В Криеченко А.И. и др. Патофизиология микроциркуляции и гемостаза. - СПб., 1998.
2. Деркачев Э.Ф., Миндукшее И.В., КриеченкоА. И., и др. Способ исследования активации и агрегации тромбоцитов. Патент RU 2108579 С1 6 GO I N33/49 (1996).
3. Миндукшее И.В. Исследование кинетики активации и агрегации тромбоцитов методом малоуглового светорассеивания: автореф. дисс. - СбПГУ, 1996.
4. Стукоевина А. Ю., Черников М. В., Гоечко О. Ю. Тез. докл. VIII Регион, конф. молодых исследователей Волгоградской области. - Волгоград, 2003.
5. Сакаев М. Р., Миндукшее И. В., Лесиовская Е. Е. и др. // Эксперим. и клинич. фармакол. - 2000. - №3.
6. Ralevic V., BumstockJ. // Pharmacol. Rev. -1998. - Vol. 50, № 3. - P. 415-492.

Комментарии