www.polysan.ru
Перейти на страницу ООО "НТФФ "ПОЛИСАН"
РЕМАКСОЛ® - сбалансированный инфузионный раствор, обладающий гепатопротекторным действием
Нарушения кислородтранспортной функции гемоглобина при хирургическом эндотоксикозе и их коррекция ремаксолом
СтатьиОпубликовано в журнале:
«ХИРУРГИЯ», 2016, № 2, с. 55-60
Д.м.н., проф. А.П. ВЛАСОВ, д.б.н., проф. В.А. ТРОФИМОВ, к.м.н. В.А. ШИБИТОВ, к.м.н. П.А. ВЛАСОВ, к.м.н. В.А. БОЛОТСКИХ, асп. А.В. МЕЛЕШКИН, асп. Е.М. ЧАМАТКИНА
Кафедра факультетской хирургии с курсом урологии и детской урологии ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева»
Цель работы — изучить эффективность ремаксола в коррекции кислородтранспортной функции эритроцитов у больных с хирургическим эндотоксикозом.
Материал и методы. Проведен анализ клинико-лабораторного исследования 52 больных острым аппендицитом, осложненным перитонитом, разделенных на две группы: основную (n=25) и сравнения (n=27). Всем пациентам в послеоперационном периоде проводили стандартное лечение: инфузионную терапию суточным объемом 1600—2000 мл, антибактериальную — в виде комбинации полусинтетических пенициллинов и аминогликозидов, обезболивающую и десенсибилизирующую терапию. В основной группе лечение дополнялось ежедневными внутривенными капельными введениями ремаксола в объеме 400 мл, курсом 5 дней. Первую дозу препарата вводили интраоперационно или сразу же после операции. Больным проведена экстренная операция, при которой диагностированы деструктивные формы острого аппендицита, сопровождающиеся диффузным гнойным или гнойно-фибринозным перитонитом. Выполнялось удаление червеобразного отростка, санация и дренирование брюшной полости. Наблюдение и клинико-лабораторные исследования проводились в динамике — в день поступления и на 1,3, 5-е сутки после операции.
Выводы. При остром перитоните, по данным РАМАН-спектроскопии, изменяются конформация молекулы гемоглобина и его кислородсвязывающая способность, что является важным фактором в развитии общей гипоксии. Наибольшие изменения в молекуле гемоглобина выявлены через сутки после операции как следствие хирургической агрессии. Получены доказательства, что модификация конформационно-функционального состояния гемоглобина сопряжена с процессом пероксидации липидов и эндогенной интоксикацией. Установлена эффективность комбинированной терапии с ремаксолом в коррекции кислородсвязывающей функции гемоглобина при остром перитоните. Выраженное положительное действие препарата, ослабляющее проявления хирургической агрессии, отмечено уже после первого введения. Терапевтическая эффективность препарата обусловлена его способностью уменьшать интенсивность перекисного окисления липидов. Сравнительно быстрое восстановление показателей гомеостаза, в частности уменьшение явлений общей гипоксии при использовании ремаксола, приводило к положительному клиническому эффекту.
Ключевые слова: перитонит, гемоглобин, комбинационное рассеяние, перекисное окисление липидов, гипоксия, эндоинтоксикация, ремаксол.
Violations of oxygen transport function of hemoglobin in surgical endointoxication and their correction using remaxol
A.P. Vlasov, V.A. Trofimov, V.A. Shibitov, P.A. Vlasov, V.A. Bolotskikh, A.V. Meleshkin, E.M. Chamatkina
Chair of Faculty Surgery with the course of Urology and Pediatric Urology, N.P. Ogarev Mordovia State University
Aim. To study the effectiveness of remaxol in erythrocytes oxygen transport function correction in patients with surgical endotoxicosis.
Material and methods. Two groups of patients (main (n = 25) and comparison (n = 27) groups) with acute appendicitis complicated by peritonitis were compared. All patients underwent standard postoperative treatment including infusion therapy 1600—2000 ml/day, antibiotics as combination of semi-synthetic penicillins and aminoglycosides, anesthetic and desensitizing therapy. In the main group daily intravenous infusion of remaxol 400 ml for 5 days was used. The first dose was administered intraoperatively or immediately after surgery. Patients underwent emergency surgery and destructive forms of acute appendicitis accompanied by diffuse purulent or purulent-fibrinous peritonitis were diagnosed. Removal of appendix, debridement and drainage of the abdominal cavity were performed. Observation of clinical and laboratory tests were carried out at admission and in 1, 3, 5 days after surgery.
Conclusion. Acute peritonitis leads to changes of hemoglobin conformation and its oxygen-binding capacity according to spectroscopy that is an important factor in the development of general hypoxia. The greatest changes in the hemoglobin molecule were found in the 1st day after surgery as a result of surgical aggression. It is proved that modified conformational state of hemoglobin is associated with processes of lipid peroxidation and endogenous intoxication. Combined therapy with remaxol is effective to correct oxygen transport function of hemoglobin in acute peritonitis. Pronounced positive effect of the drug weakening manifestations of surgical aggression is noted after the first administration. Therapeutic efficacy of the drug is explained by its ability to reduce lipid peroxidation. Rapid recovery of homeostasis including decrease of general hypoxia using remaxol resulted in a clinical benefit.
Keywords: peritonitis, hemoglobin, Raman scattering, lipid peroxidation, hypoxia, endointoxication, remaxol.
Введение
Синдром эндогенной интоксикации в современной хирургии занимает важнейшее место [3, 8]. При острых гнойно-воспалительных заболеваниях он выступает ведущим в развитии полиорганной недостаточности, крайним негативным итогом которой зачастую является фатальный исход [1, 10]. В основе нарушения органных функций лежат системные микроциркуляторные расстройства и гипоксия, которые обусловливают изменения метаболизма, нарушение окислительного фосфорилирования с возможными дегенеративно-деструктивными изменениями в клетках. Важнейшим патогенетическим компонентом мембранодеструктивного процесса является оксидативный стресс, при котором образуются весьма токсичные продукты, что еще в большей степени отягощает эндоинтоксикацию [6, 11, 13]. Фактически создаются реальные условия придания этому процессу аутокаталитической направленности, что в значительной степени утяжеляет решение задачи по поиску эффективной терапии. Очевидно, что лечебная программа по уменьшению эндотоксикоза должна воздействовать не только на основной очаг, но и обладать способностью купировать (предупреждать прогрессирование) процессы, формирующие дополнительный источник интоксикации, в частности за счет гипоксии [2]. В этой связи немалый интерес вызывает препарат ремаксол, который в своем составе имеет фармакологические компоненты, обладающие способностью уменьшать явления гипоксии и перекисного окисления липидов (ПОЛ) [4]. Отметим, что значимость гемоглобина в патогенезе гипоксии известна и детально изучена. Однако конкретные функциональные и структурные изменения в его молекуле исследованы недостаточно полно [8, 15]. Развитие оптико-спектральных методов вызвало появление огромного количества направлений в различных областях, в том числе биологии и медицине, и в последнее время оптико-спектральные методы являются незаменимыми при решении широкого круга исследовательских и прикладных задач. В последнее время появились работы по оценке структурно-функционального состояния гемоглобина при различных патологиях [8, 14].
Цель работы — изучить эффективность ремаксола в коррекции кислородтранспортной функции эритроцитов у больных с хирургическим эндотоксикозом.
Материал и методы
Проведено клинико-лабораторное исследование 52 больных (35 (67,3%) мужчин и 17 (32,7%) женщин, средний возраст 40,3±2,6 года) острым аппендицитом, осложненным перитонитом, распределенных в основную группу (n=25) и группу сравнения (n=27).
Всем больным в послеоперационном периоде проводили стандартное лечение: инфузионную терапию суточным объемом 1600—2000 мл (Sol. Glucosae 5% + Insulini из расчета 1 ЕД на 4 г сухого вещества глюкозы, Sol. Natrii chloridi 0,89%, Ringer-Lokk и другие солевые растворы внутривенно капельно); антибактериальную терапию в виде комбинации полусинтетических пенициллинов (Ampicillinum, Ampioxum, Oxacillinum по 1,0 г 4 раза в сутки внутримышечно) и аминогликозидов (Gentamycinum 0,08 г 2 раза в сутки внутримышечно); обезболивающую терапию: наркотические (Sol. Promedoli 2% — 1 мл внутримышечно в течение первых суток каждые 6 ч) и ненаркотические (Sol. Analgini 50% — 2 мл внутримышечно) анальгетики; десенсибилизирующую терапию (Sol. Dimedroli 1% — 1 мл внутримышечно).
В основной группе терапия пополнялась ежедневными в течение 5 сут внутривенными капельными введениями ремаксола в объеме 400 мл. Первую дозу препарата вводили интраоперационно или сразу же после операции.
Больным проведена экстренная операция, при которой диагностированы деструктивные формы острого аппендицита, сопровождающиеся диффузным гнойным или гнойно-фибринозным перитонитом. Выполнялись удаление червеобразного отростка, санация и дренирование брюшной полости. Для изучения параметров гомеостаза больным в день поступления и на 1, 3, 5-е сутки после операции производили забор венозной крови.
Для получения данных, которые приняты за условную физиологическую норму, проведены исследования у 25 здоровых добровольцев обоего пола.
Исследования велись на основе информированного согласия участников в соответствии с международными этическими требованиями ВОЗ (правила GCP — Good Clinical Practice), предъявляемыми к медицинским исследованиям с участием человека (Женева, 1993).
Оценивали эндогенную интоксикацию: содержание молекул средней массы определяли спектрофотометрическим методом на спектрофотометре СФ-46 при длинах волн 254 и 280 нм; общую (ОКА) и эффективную концентрацию альбумина (ЭКА) в сыворотке крови — флюоресцентным методом на специализированном анализаторе АКЛ-01 Зонд. Резерв связывания альбумина определяли по формуле РСА=ЭКА/ОКА, индекс токсичности плазмы по формуле ИТ=ОКА/ЭКА-1. Оценивали интенсивность ПОЛ: диеновые конъюгаты определяли спектрофотометрическим методом при длине волны 232—233 нм; уровень малонового диальдегида — спектрофотометрическим методом в реакции с тиобарбитуровой кислотой [7]. Исследовали конформацию и свойства гемоглобина эритроцитов с применением метода спектроскопии комбинационного рассеивания. Регистрацию спектров комбинационного рассеивания (КР) проводили с помощью рамановского спектрометра in via Basis фирмы «Renishaw» (UK) с лазером, генерирующим возбуждающий свет с длиной волны 532 нм, резонансной для молекулы гемоглобина, в течение 20 с при мощности лазера 1,5 мВт. Для анализа конформации и О2-связывающих свойств гемоглобина использовали соответствующие полосы спектров КР эритроцитов с максимумами при 1355, 1375, 1548—1552, 1580—1588 см-1 соответственно. Относительное количество оксигемоглобина в эритроцитах определяли как отношение интенсивностей I1375/(I1355+I1375) (I). Относительная способность гемоглобина связывать лиганды рассчитывалась как отношение IB55/Ii550 (II), относительная способность гемоглобина выделять лиганды — как отношение I1375/I1580 (III), сродство гемоглобина к лигандам (О2) — как отношение (I1355/I1550)/(I1375/I1580) (IV), информационные изменения пирролов — как отношение I1375/ I1172 (V) [12, 15]. При оценке тяжести перитонита использован Мангеймский индекс.
Статистическую обработку полученных данных осуществляли с помощью пакета прикладных программ Microsoft Excel 2007, Statistica 6.0 с помощью параметрических и непараметрических критериев для двух независимых групп данных.
Результаты и обсуждение
При поступлении у больных диагностирован острый аппендицит, осложненный перитонитом, что подтверждено и интраоперационно. Тяжесть перитонита в исследованных группах оказалась сопоставимой, на что указал Мангеймский индекс, который в группе сравнения составил 21,7 ± 1,17, в основной — 22,7±1,27 (II степень тяжести). Отметим, что у больных обеих групп выраженность эндогенной интоксикации при поступлении в клинику, оцененная по уровню токсических продуктов гидрофильной и гидрофобной природы, а также интенсивность процесса перекисного окисления липидов и явления общей гипоксии, также были сопоставимыми. Таким образом, означенные данные дают основание для адекватной оценки эффективности ремаксола в лечении перитонита и влияния его на ключевые показатели гомеостаза, в том числе структурно-функциональное состояние гемоглобина, показатели которого у больных обеих групп при поступлении в клинику были также сопоставимыми.
Вначале проведен анализ результатов клиниколабораторных исследований в группе сравнения: в раннем послеоперационном периоде, через сутки после операции, значения всех исследованных показателей гомеокинеза изменялись в большей степени, чем при поступлении. Парадокс усугубления расстройств гомеостаза в первые сутки после операции известен [2]. В основе его лежат хирургическая агрессия и наркоз. Безусловно, важнейшим негативным проявлением выступает утяжеление синдрома эндогенной интоксикации. Уровень токсичных продуктов в крови через сутки после операции по сравнению с дооперационным повышался на 12,3—13,8% (рОсобый интерес вызвал установленный факт больших конформационных и функциональных изменений гемоглобина через сутки после операции. Значения почти всех исследованных показателей достоверно отличались от дооперационного уровня на 7,1—17,8% (рВ последующие этапы наблюдения расстройства гомеостаза у больных группы сравнения уменьшались. Однако на конечном этапе наблюдения изменения исследованных показателей достоверно отличались от нормы (табл. 1, 2).
Таблица 1. Некоторые показатели гомеостаза у больных острым перитонитом на фоне комбинированной терапии с ремаксолом (М±m)
| Показатель | Норма (контроль) |
Группа | Этапы наблюдения | |||
| до операции | после операции | |||||
| 1-е сутки | 3-и сутки | 5-е сутки | ||||
| МСМ (λ=280 нм), усл. ед. (·10–3) | 249,2±19,1 | I | 473,6±23,3* | 591,1±26,2*# | 427,3±23,4* | 356,7±24,1* |
| II | 488,6±25,8* | 522,1±26,7* | 350,3±21,0* | 283,3±25,4* | ||
| МСМ (λ=254 нм), усл. ед. (·10–3) | 296,4±22,2 | I | 502,3±28,4* | 619,7±30,8*# | 488,5±27,3* | 391,2±30,8* |
| II | 502,3±28,4* | 541,3±25,5* | 403,9±28,3* | 308,6±27,9* | ||
| ОКА, г/л | 50,2±2,3 | I | 47,3±2,2 | 41,8±2,4*# | 40,5±2,3* | 45,9±2,4* |
| II | 48,1±2,3 | 42,2±2,5*# | 45,8±2,5* | 48,2±2,6 | ||
| ЭКА, г/л | 45,8±2,5 | I | 29,8±2,8* | 22,3±2,6*# | 29,4±2,3* | 32,9±2,5* |
| II | 30,3±2,5* | 27,8±2,4* | 36,7±2,4* | 39,2±2,6* | ||
| РСА, усл. ед. | 0,88±0,04 | I | 0,63±0,04* | 0,53±0,03*# | 0,70±0,03* | 0,73±0,04* |
| II | 0,65±0,03* | 0,67±0,04* | 0,79±0,03* | 0,81±0,05* | ||
| ИТ, усл. ед. | 0,13±0,01 | I | 0,62±0,03* | 0,86±0,06*# | 0,36±0,04* | 0,39±0,05* |
| II | 0,63±0,02* | 0,57±0,05* | 0,25±0,03* | 0,24±0,04* | ||
| Диеновые конъюгаты, усл. ед./мг липидов | 0,232±0,017 | I | 0,389±0,032* | 0,493±0,038*# | 0,446±0,043* | 0,388±0,035* |
| II | 0,375±0,036* | 0,402±0,041* | 0,328±0,042* | 0,302±0,034 | ||
| ТБК-активные продукты, нмоль/мл | 4,3±0,3 | I | 7,4±0,4* | 8,7±0,5*# | 7,2±0,4* | 6,3±0,4* |
| II | 7,6±0,6* | 7,1±0,4* | 6,0±0,3* | 5,2±0,3* | ||
| Молочная кислота, ммоль/г белка | 0,23±0,02 | I | 0,41±0,04* | 0,59±0,03*# | 0,43±0,04* | 0,34±0,03* |
| II | 0,40±0,03* | 0,48±0,04* | 0,33±0,03* | 0,25±0,04 | ||
| Пировиноградная кислота, ммоль/г белка | 0,034±0,003 | I | 0,052±0,005* | 0,057±0,004* | 0,050±0,003* | 0,046±0,004* |
| II | 0,051±0,006* | 0,049±0,005* | 0,041±0,003* | 0,036±0,004 | ||
| Индекс гипоксии | 6,72±0,25 | I | 8,19±0,19* | 10,34±0,24*# | 8,45±0,21* | 7,57±0,32* |
| II | 8,21±0,23* | 9,73±0,28*# | 7,81±0,36* | 6,88±0,30 | ||
Примечание. Здесь и в табл. 2: I — группа сравнения; II — основная группа (получавшие ремаксол); МСМ — молекулы средней массы; ОКА — общая концентрация альбумина; ЭКА — эффективная концентрация альбумина; РСА — резерв связывания альбумина (ЭКА/ ОКА); ИТ — индекс токсичности плазмы по альбумину (ОКА/ЭКА-1); * — достоверные изменения по сравнению с нормой при p
Таблица 2. Показатели РАМАН-спектроскопии гемоглобина у больных острым перитонитом на фоне комбинирован- ной терапии с ремаксолом (М±m)
| Показатель | Норма | Группа | Этапы наблюдения | |||
| до операции | после операции | |||||
| 1-е сутки | 3-и сутки | 5-е сутки | ||||
| Относительное количество оксигемоглобина в эритроцитах (I1375/(I1355+I1375)) | 0,641±0,012 | I | 0,678±0,016* | 0,722±0,019*# | 0,698±0,016* | 0,689±0,013* |
| II | 0,679±0,018* | 0,702±0,021* | 0,663±0,017* | 0,651±0,018 | ||
| Относительная способность гемоглобина связывать лиганды (I1355/I1550) | 0,629±0,017 | I | 0,581±0,023* | 0,567±0,018* | 0,578±0,014* | 0,580±0,017* |
| II | 0,573±0,025* | 0,5780,018* | 0,611±0,013 | 0,622±0,016 | ||
| Относительная способность гемоглобина выделять лиганды (I1375/I1580) | 0,694±0,016 | I | 0,653±0,017* | 0,607±0,019*# | 0,628±0,020* | 0,641±0,018* |
| II | 0,657±0,019* | 0,649±0,017* | 0,669±0,017* | 0,688±0,019 | ||
| Сродство гемоглобина к лигандам (О2) (I1355/I1550)/(I1375/I1580) | 0,931±0,021 | I | 0,912±0,014 | 0,782±0,016*# | 0,829±0,020* | 0,856±0,019* |
| II | 0,919±0,017 | 0,824±0,017* | 0,881±0,022* | 0,921±0,021 | ||
| Колебания метиновых мостиков гемоглобина (I1375/I1172) | 1,429±0,043 | I | 1,537±0,088 | 1,812±0,092*# | 1,823±0,071* | 1,799±0,068* |
| II | 1,528±0,074 | 1,623±0,087* | 1,611±0,063* | 1,592±0,049* | ||
Таким образом, исследования в группе сравнения показали, что при остром перитоните регистрируются существенные изменения конформационно-функционального состояния гемоглобина, что, безусловно, является немаловажным в патогенезе общей гипоксии. Анализ спектров КР показал, что конформационная структура гемопорфирина и, как следствие, кислородсвязывающая способность гемоглобина в эритроцитах в первые сутки после операции изменяются в наибольшей степени, что утяжеляет состояние больных и вкупе с другими расстройствами может явиться неблагоприятным фоном для развития осложнений. Изменение кислородсвязывающей способности эритроцитов происходит на фоне активации ПОЛ. Повышенное содержание ТБК-реактивных продуктов, в частности малонового диальдегида могут приводить к образованию ковалентных сшивок между функциональными группами белков с образованием высокомолекулярных аддуктов. В результате образования крупных агрегатов гемоглобина, полученных путем сшивки глутаровым альдегидом нескольких десятков молекул друг с другом, сродство образующихся комплексов к кислороду уменьшается [5].
Следовательно, установленные изменения в молекуле гемоглобина и их сопряженность с ПОЛ и эндогенной интоксикацией (r=0,834—0,973, рВыявлено, что на фоне комбинированной терапии с ремаксолом (первая доза препарата вводилась интраоперационно или сразу же после операции) уже в первые сутки раннего послеоперационного периода отмечены существенные положительные изменения в оцененных компонентах гомеостаза. В то же время изменений в показателях в группе сравнения выявлено не было. Важным эффектом оказалась способность комбинированной терапии уже через 5 сут восстанавливать почти все исследованные показатели.
Установлено, что достоверный положительный эффект у пациентов, получавших ремаксол, в отличие от группы сравнения, выявлен фактически по всем показателям на всех этапах периода наблюдения (см. табл. 1, 2). Так, уровень токсических продуктов гидрофильной природы в крови при использовании комбинированной терапии, по сравнению с группой сравнения, уменьшался на 12,7— 21,3% (рОсобый интерес вызвала эффективность комбинированной терапии с ремаксолом в отношении конформационных и функциональных изменений гемоглобина. Уже через сутки относительная способность гемоглобина выделять лиганды, в отличие от группы сравнения, возрастала на 6,9% (р2) — на 5,3% (рДинамика восстановления конформационных и функциональных показателей гемоглобина на фоне терапии с ремаксолом коррелировала с уменьшением интенсивности процесса ПОЛ и выраженности эндогенной интоксикации (r=0,756—0,958, рСущественное уменьшение расстройств гомеостаза на фоне комбинированной терапии с ремаксолом сопровождалось улучшением клинических показателей. В частности, выявлено сравнительно быстрое купирование воспалительного процесса в брюшной полости. Так, в основной группе больных диагностировано уменьшение выделения экссудата по дренажам на 14,5—28,9% (рВыводы
При остром перитоните изменяются конформация молекулы гемоглобина и его кислородсвязывающая способность, что является немаловажным в развитии общей гипоксии. Наибольшие изменения в молекуле гемоглобина выявлены через сутки после операции как следствие хирургической агрессии. Получены доказательства, что модификация конформационно-функционального состояния гемоглобина сопряжена с процессом пероксидации липидов и эндогенной интоксикацией. Установлена эффективность комбинированной терапии с ремаксолом в коррекции кислородсвязывающей функции гемоглобина при остром перитоните. Выраженное положительное действие препарата, ослабляющее проявления хирургической агрессии, отмечено уже после первого введения. Терапевтическая эффективность препарата обусловлена его способностью уменьшать интенсивность ПОЛ и выраженность эндогенной интоксикации. Сравнительно быстрое восстановление показателей гомеостаза, в частности уменьшение явлений общей гипоксии при использовании ремаксола приводило к положительному клиническому эффекту.
ЛИТЕРАТУРА
1. Багненко С.Ф., Мирзабаев А.Т., Батоцыренов Б.В. Вестник хирургии им. И.И. Грекова. 2011;170:5:14-18.
2. Власов А.П., Трофимов В.А., Крылов В.Г. Системный липидный дистресс-синдром в хирургии. М.: Наука; 2009;224.
3. Гринев М.В. Вестник хирургии им. И.И. Грекова. 2009;168:1:9-13.
4. Коваленко А.Л., Петров А.Ю., Суханов Д.С. и др. Экспериментальная и клиническая фармакология. 2011;74:1:32-35.
5. Кузнецова Н.П., Гудкин Л.Р., Мишаева Р.Н. RU 2132687, МПК G01N33/487, опубл. 10.07.99.
6. Лукьянова Л.Д., Германова Э.Л., Цыбина Т.А. и др. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2009;148:10:388-392.
7. Медицинские лабораторные технологии: Справочник. Под ред. Карпищенко А.И. СПб.: Интермедика; 1999.
8. Митянина В.А., Паршина Е.Ю., Юсипович А.И., Максимов Г.В., Селищева А.А. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2012;153:4:499-503.
9. Петухов В.А., Магомедов М.С. Хирургия (Приложение к журналу Consilium medicum). 2008;2:37-46.
10. Сандаков П.Я., Старикова А.И. Хирургия. 2014;4:16-19.
11. Харченко Д.А., Дубинский Н.В., Лысенко Б.Ф., Ксендз И.В., Туник Р.А. Клиническая хирургия. 2011;8:36-38.
12. Brazhe NA, Abdali S, Brazhe AR, Luneva OG, Bryzgalova NY, Parshina EY, Sosnovtseva OV, Maksimov GV. Biophysical Journal. 2009;97:I.12:3206-3214.
13. Kiewiet JJ, van Ruler О, Boermeester MA. BMC Surg. 2013;1913:28.
14. Wood BR, Caspers P, Puppels GJ, Pandiancherri S, Mc-Naughton D. Anal Bioanal Chem. 2007;387:3:1691-1703.
15. Pauly S, Schulze FP, Horstman O. Chir. 2013;138:3:289-294.
