Влияние глутамина на фагоцитоз и бактерицидную активность нейтрофилов здоровых людей и детей с ожогами

Опубликовано в журнале:
Journal of Parenteral and Enteral Nutrition (Журнал парентерального и перорального питания) »» 1994; 18 (2): 128-133

Кора К. Огл,^1* Джеймс Д. Огл,² Джу-Ксиан Мао,¹ Джоди Симон,² Джон Дж. Ноел,² Бинг-Гуо Ли² и Дж. Уесли Александер^1
1 Хирургическое отделение медицинского колледжа при университете Цинциннати, США
² Ожоговый институт Shriners, Цинциннати, США
* Автор для переписки: Dr. Cora K. Ogle, Shriners Burns Institute, 3229 Burnet Ave., Cincinnati, OH 42229-3095, USA

Резюме.

Глутамин играет важную роль в жизнедеятельности лимфоцитов и макрофагов, в которых он, помимо других функций, является источником энергии. О том, какой энергетический субстрат используют для своего метаболизма и бактерицидного действия полиморфноядерные клетки, известно очень мало. Целью данного исследования было изучение вопроса о том, усиливает ли глутамин бактерицидную активность нейтрофилов здоровых людей in vitro, и способна ли эта аминокислота восстанавливать до нормального уровня или еще выше нарушение функций нейтрофилов, наблюдаемое у больных с ожогами. В исследовании участвовали 12 больных с ожогами, затрагивающими от 32 до 87% поверхности тела. В разные сроки после  ожога выделяли нейтрофилы крови и определяли их бактерицидную активность в отношении Staphylococcus aureus в присутствии и в отсутствие глутамина. Полученные данные сравнивали с соответствующими показателями для нейтрофилов здоровых людей. Глутамин усиливал бактерицидное действие нейтрофилов здоровых людей. У всех больных с ожогами во все моменты измерения, кроме двух, глутамин улучшал ослабленную бактерицидную активность нейтрофилов и часто восстанавливал ее до нормального уровня или чуть выше его. При этом глутамин не влиял на экспрессию рецептора С3b (CD1, или CD35) и на фагоцитарную активность клеток. Полученные результаты подтверждают благоприятное действие глутамина по крайней мере на один компонент иммунной системы и дают дополнительные доказательства возможного преимущества добавления этой аминокислоты в диету больных с ожогами и другими травмами.

Аминокислота глутамин необходима для обеспечения оптимальной пролиферации и функций лимфоцитов и для поддержания нормальной функции непролиферирующих клеток, например, макрофагов.^1,2 Эта распространенная аминокислота играет либо ключевую, либо вспомогательную роль в таких процессах, как биосинтез нуклеиновых кислот и белков, синтез и расщепление глюкозы, формирование липидного слоя мембран и получение энергии.¹ Количество глутамина, необходимое для этих клеточных процессов, значительно превосходит то, которое человек получает с обычной пищей. В норме эта аминокислота также синтезируется в мышечной ткани из заменимых аминокислот (большей частью разветвленных) и глюкозы, и при нарушении белкового метаболизма в мышцах синтез эндогенного глутамина тоже может нарушаться. Действительно, после ожога концентрация глутамина в крови резко падает.³ В моделях на животных проведены многочисленные исследования влияния глутамина на функции иммунной системы in vivo и in vitro, в том числе исследования с добавкой глутамина в пищу.^4,5 Хотя эффекты добавки глутамина в схемы питания больных с ожогами и другими травмами изучались несколько лет, степень благоприятного действия глутамина и механизмы наблюдавшихся благоприятных эффектов до конца не установлены.^6,7 Имеется очень мало информации об энергетических субстратах, используемых полиморфноядерными клетками (ПМК) для осуществления метаболических и бактерицидных процессов. Работы, проведенные ранее в нашей лаборатории, показали нарушение функций нейтрофилов, выделенных от больных с ожогами и травмами.⁸ Целью данного исследования являлось изучение вопроса о том, усиливает ли глутамин бактерицидное действие ПМК здоровых людей in vitro, и способна ли эта аминокислота восстанавливать до нормального уровня или выше нарушение функций ПМК, наблюдаемое у больных с ожогами. Также исследовали влияние глутамина на экспрессию рецептора С3b (CR1) и на фагоцитарную активность нейтрофилов, поскольку связывание с рецепторами и фагоцитоз бактерий являются необходимыми условиями проявления бактерицидного действия ПМК. Мы также оценивали влияние глутамина на фагоцитарную и бактерицидную функцию ПМК, выделенных от здоровых людей и обработанных хемотаксическим пептидом формил-метионин-лейцил-фенилаланином (ФМЛФ) для симуляции их угнетенного состояния у больных с ожогами.

Материалы и методы

Пациенты

Исследование проводилось с разрешения и в соответствии с рекомендациями научного совета университета Цинциннати. Для участия в исследовании были последовательно отобраны 12 детей обоего пола, от родителей которых было получено информированное согласие. Средний возраст детей составлял 10 лет (разброс 4-18 лет), площадь ожога колебалась от 32 до 87% поверхности тела. 6 больных наблюдались в течение 1-2 недель, и еще 6 - в течение 5-11 недель. От больных еженедельно получали образцы крови для выделения нейтрофилов и одновременно анализировали кровь от какого-либо здорового взрослого донора. Использование здорового ребенка в качестве контроля с этической точки зрения было неприемлемо. Ко времени выписки из клиники большинство детей с ожогами имели индекс бактерицидной активности нейтрофилов, близкий к 1. Кроме того, при изучении влияния глутамина на функции нейтрофилов взрослые доноры служили контролями сами для себя.

Выделение нейтрофилов.

Клетки выделяли по модификации⁹ методов Александера и соавт.¹⁰ и Ферранте и Тонга.¹¹ 40 мл периферической крови набирали в шприц, содержащий 8 мл 6% декстрана Т500 (Pharmacia, США) и 1,2 мл раствора гепарина для инъекций (1000 Ед/мл) (Elkins-Sinn Inc., США). Шприц с собранной кровью оставляли на 45-60 мин в вертикальном положении для отделения плазмы от эритроцитов. После этого через угловую иглу плазму выдавливали из шприца в 50-мл центрифужную пробирку. Под слой плазмы вносили 10 мл раствора Histopague (Sigma Chemical Co., США) и центрифугировали в течение 30 минут при 500 g и 27^оС. Супернатант с моноядерными клетками удаляли, а осадок, содержащий нейтрофилы, ресуспензировали в гипотоническом растворе для лизирования примеси эритроцитов. Полученная суспензия клеток содержала > 95% жизнеспособных нейтрофилов, что устанавливали микроскопически путем окрашивания гемциан-фиолетовым и по результатам выведения трипанового голубого. Клетки промывали 2 раза сбалансированным солевым раствором Хенкса (Gibco, США) и суспензировали в известном объеме раствора Хенкса с добавлением кальция и магния. Нейтрофилы подсчитывали и доводили суспензию до концентрации 1 х 10⁷ клеток/мл.

Обработка нейтрофилов глутамином или ФМЛФ

Суспензию нейтрофилов инкубировали с бактериями (см. ниже) и глутамином (20-30 ммоль/л) в течение 2 часов при 37^оС. Контрольные клетки инкубировали либо с бактериями и буфером, либо только с глутамином. Для изучения влияния глутамина на нейтрофилы, обработанные ФМЛФ, клетки предварительно инкубировали с ФМЛФ (10^-7 моль/л) в течение 30 минут при 37^оС, а затем - с бактериями и глутамином, как описано выше. Для исследования влияния глутамина на фагоцитоз в присутствии ФМЛФ клетки инкубировали в течение 30 минут с глутамином (0,3-30 ммоль/л) и ФМЛФ (10^-6 моль/л). Концентрацию глутамина в супернатанте клеток определяли на аминокислотном анализаторе Beckman System 6300 (Beckman Instruments, США).

Анализ бактерицидной активности

Способность нейтрофилов уничтожать Streptococcus aureus определяли по методу Александера и Микинса.⁸ Готовили смесь суспензии нейтрофилов и суспензии бактерий в растворе Хенкса таким образом, чтобы 900 мкл смеси содержали 5 х 10⁶ нейтрофилов и 1 х 10⁷ бактерий. Добавляли 100 мкл цельной сыворотки человека и инкубировали в течение 2 часов при 37^оС и непрерывном встряхивании. После этого отбирали 100 мкл смеси и разбавляли их в 10 раз стерильной водой (900 мкл). Это и еще два дальнейших 10-кратных разведения наносили на агар из трипсинизированной сои и инкубировали в течение ночи при 37^оС. После этого подсчитывали количество колоний (колониеобразующих единиц, КОЕ). Рассчитывали индекс бактерицидной активности (ИБА) путем деления количества КОЕ, полученных при высевании клеток, обработанных  глутамином, ФМЛФ или глутамином/ФМЛФ, на количество КОЕ, полученных при высевании контрольных необработанных клеток, а также путем деления количества КОЕ, полученных при высевании смеси бактерий и ПМК пациентов, на количество КОЕ, полученных при высевании смеси бактерий и ПМК здоровых людей. ИБА, равный 4, означает, что в присутствии нейтрофилов, обработанных  глутамином, ФМЛФ или глутамином/ ФЛМФ, выживало в 4 раза больше бактерий, чем в присутствии необработанных нейтрофилов, а в присутствии нейтрофилов пациентов выживало в 4 раза больше бактерий, чем в присутствии нейтрофилов здоровых людей. Таким образом, значение ИБА, равное 1, является нормой, а увеличение этого индекса свидетельствует об ослаблении бактерицидной активности нейтрофилов. Этот индекс используется только в экспериментальных исследованиях, которые показали, что ИБА, равный 10, соответствует уничтожению примерно 80% бактерий, ИБА 4 - примерно 92% бактерий, а ИБА 1 - примерно 98% от исходного количества бактерий, которое составляло 10⁶.⁸ Хотя в качестве контроля для оценки бактерицидной функции нейтрофилов пациентов использовали нейтрофилы взрослых здоровых доноров, индекс ИБА у большинства больных, не находящихся в критическом состоянии и подвергавшихся пластическим операциям, был близок к норме. Кроме того, при определении влияния глутамина на функции нейтрофилов пациенты фактически являлись контролем для самих себя. 

Анализ экспрессии рецептора CR1 и фагоцитарной активности

Экспрессию CR1 определяли путем инкубации нейтрофилов сначала с мышиными моноклональными антителами к СR1, а затем - с меченными флуоресцеин-изотиоцианатом антителами козы к иммуноглобулину G (IgG) мыши.⁹ В другом варианте экспрессию CR1 оценивали по общему связыванию микросфер с клетками в описанном ниже анализе фагоцитарной активности. Фагоцитоз исследовали по методу Огла с соавт.¹² с использованием в качестве частиц-мишеней микросфер с сорбированными на их поверхности рецепторами C3b и зеленым флуоресцентным белком (GFP). После инкубации микросфер с клетками смесь охлаждали, центрифугировали через слой 6% бычьего сывороточного альбумина в буфере для удаления несвязанных микросфер и окрашивали при 4^оС моноклональными антителами к C3b и затем меченными Техасским красным антителами козы против IgG мыши. После этого клетки промывали, фиксировали 1% параформальдегидом и регистрировали флуоресценцию в красной и зеленой полосах спектра на проточном цитофлуориметре 753Epics (Coulter Corp., США). Из полученных значений флуоресценции рассчитывали активность фагоцитоза и количество связавшихся с клетками микросфер (т.е. количество рецепторов CR1).^9,12,13

Рис.1
Усиление бактерицидной активности нейтрофилов здоровых людей под влиянием разных концентраций глутамина. Расчет ИБА описан в разделе “Материалы и методы”. Достоверное усиление наблюдалось при концентрациях глутамина 1 ммоль/л и выше (р=0,001).

Статистический анализ

Поскольку индекс ИБА рассчитывают путем нормализации функции нейтрофилов пациентов к функции нейтрофилов доноров, то данные о влиянии глутамина на этот показатель в клетках пациентов анализировали в Т- тесте для связанных переменных, а сравнение этого показателя в необработанных клетках пациентов и в клетках доноров, а также сравнение обработанных и необработанных клеток доноров проводили в Т-тесте Стьюдента для одной переменной (для необработанных клеток доноров этот показатель принимали за 1).

Результаты

Влияние разных концентраций глутамина на бактерицидную активность нейтрофилов здоровых людей показано на рисунке 1. Величину ИБА рассчитывали на основании подсчета выживших бактерий; таким образом, более низкие значения соответствуют более высокой бактерицидной активности клеток (см. “Материалы и методы” и метод Александера и Микинса⁸). Глутамин в концентрации 1 ммоль/л усиливал бактерицидную активность ПМК (р=0,001), но при дальнейшем повышении дозы эффект глутамина не усиливался. Сам глутамин (в отсутствие нейтрофилов) не вызывал ни гибели, ни усиления роста бактерий.

На рисунке 2 показано влияние глутамина на бактерицидную активность нормальных нейтрофилов, обработанных ФМЛФ (10^-7 моль/л) для симуляции частичного нарушения их функций, вызванного термическим повреждением. Обратите внимание, что контрольные ПМК (обработанные ФМЛФ, но не подвергавшиеся воздействию глутамина) имели ИБА больше 2; таким образом, сам ФМЛФ ослаблял бактерицидную активность клеток. Глутамин в концентрациях 20 ммоль/л и более восстанавливал бактерицидную активность клеток, обработанных ФМЛФ, до уровня интактных ПМК (не обработанных ни ФМЛФ, ни глутамином), т.е. ИБА клеток приближался к 1. Однако глутамин не усиливал бактерицидной активности клеток, обработанных ФМЛФ, выше контрольного уровня (т.е. необработанных клеток), в отличие от эффекта глутамина в нейтрофилах, не обработанных ФМЛФ (см. рис.1).

Таблица 1.
Влияние глутамина (20-30 мМ) на бактерицидную активность нейтрофилов больных с ожогами

В таблице 1 суммированы данные о влиянии глутамина (20 ммоль/л) на бактерицидную активность ПМК, выделенных от 12 больных с ожогами разной тяжести. В большинстве случаев ПМК от каждого больного получали в разные сроки после ожога. У всех больных почти во все сроки измерения бактерицидная активность ПМК была снижена по сравнению с контролем (p<0,001); средний ИБА для 54 измерений составлял 3,6 + 0,5 (SEM) при разбросе от 0,6 до 23,3.

У всех больных во все сроки измерения, кроме двух, глутамин усиливал ослабленную бактерицидную активность нейтрофилов (p<0,0001), и средний ИБА при применении глутамина составлял 2,5 + 0,4. Бактерицидную активность нейтрофилов каждого больного в каждый момент измерения сравнивали с активностью нейтрофилов какого-нибудь здорового донора (не обязательно одного и того же для каждого больного) в присутствии и в отсутствие глутамина. Средний ИБА для 54 измерений активности ПМК в присутствии глутамина составил 0,6 + 0,03, что отражает повышение активности во всех случаях, кроме 4 (p<0,0001).

На рисунке 3 представлен график изменения ИБА нейтрофилов пациента №12 (см. таблицу 1) в разные сроки после ожога. И в присутствии, и в отсутствие глутамина заметен цикличный характер активности клеток, который выявлялся и у других больных, обследованных в течение 5 и более недель после ожога. 

В определенные сроки после ожога у некоторых больных наблюдались эпизоды сепсиса, которые, однако, не коррелировали со значениями ИМБ. Периоды сепсиса у больного №12 показаны на рис.3 крестиками. 

Также было изучено влияние другой аминокислоты, участвующей в синтезе глюкозы, - глицина - на бактерицидную активность контрольных нейтрофилов, не обработанных ФМЛФ. Эта аминокислота не влияла на бактерицидную активность ПМК. Средний ИБА нейтрофилов, обработанных и необработанных глицином, составил соотв. 0,9 + 0,3 (n=5) и 1,5 + 0,2 (n=3).

Через 2 часа инкубации смеси ПМК и бактерий с глутамином (1 или 20 ммоль/л) отмечалось снижение содержания глутамина в инкубационной среде клеток, причем в инкубационной среде смеси, содержащей ПМК здоровых доноров и пациентов, это снижение составило соотв. 1% и 13%. При инкубации только бактерий с глутамином концентрация аминокислоты снижалась на 17%,а в среде, не содержащей никаких клеток, этот показатель уменьшался на 20%. Таким образом, никакого накопления глутамина в клетках не наблюдалось.

Данные о влиянии глутамина на экспрессию рецептора CR1 в ПМК пациентов и здоровых людей и на фагоцитоз этими клетками микросфер с сорбированными на них рецепторами C3b суммированы в таблице 2. Концентрация глутамина колебалась от 0,3 до 30 ммоль/л. В суммированных в таблице экспериментах были исследованы ПМК, полученные от 4-6 здоровых доноров и от 2 больных с ожогами. Результаты представлены как процент от эффекта ФМЛФ (10^-6 моль/л), чтобы оценить эффективность глутамина по сравнению с ФМЛФ, который в наших исследованиях обычно использовался в качестве  положительного контроля, вызывающего повышающую регуляцию экспрессии рецепторов и усиливающего фагоцитоз. Глутамин не вызывал каких-либо существенных изменений экспрессии рецептора CR1 и фагоцитарной активности ПМК здоровых доноров, а в ПМК больного с ожогами №12 (см. таблицу 1) в первый день после выделения клеток (3 неделя после ожога) он усиливал экспрессию рецептора CR1 на 27%, а фагоцитарную активность - на 19%. Обратите внимание, что ПМК больного №11, выделенные на 3 неделе после ожога, и ПМК больного №12, выделенные на 4 неделе после ожога, по показателям экспрессии CR1 и фагоцитарной активности в момент выделения были умеренно или сильно активированы. Как видно из таблицы 1, бактерицидная активность этих клеток не была нарушена, и их ИБА в присутствии и в отсутствии глутамина была практически нормальным (соотв. примерно 1 и 2).

Также было изучено влияние глутамина на экспрессию рецептора CR1 и фагоцитарную активность клеток в присутствии ФМЛФ (10^-9 - 10^-6 моль/л). По сравнению с эффектом одного ФМЛФ изменений этих показателей не обнаружено (данные в таблице не показаны).

Обсуждение

Нейтрофилы пациентов с ожогами, участвовавших в данном исследовании, имели индекс бактерицидной активности (ИБА) от 0,6 до 23,3. Для клинических целей считается, что величина этого индекса больше 2 соответствует нарушению бактерицидной активности нейтрофилов, при чем ИБА 4-8 соответствует умеренному угнетению, а ИБА >8 - сильному торможению этой активности.⁸ Глутамин в концентрациях 20 ммоль и более усиливал бактерицидную активность нейтрофилов больных с ожогами и нейтрофилов, полученных от здоровых доноров и обработанных ФМЛФ для симуляции угнетения их активности у больных с ожогами. На основании этих наблюдений для дальнейших исследований на клетках была выбрана концентрация глутамина 20-30 ммоль/л. Концентрация глутамина в крови здоровых доноров в норме составляет 0,5-0,6 ммоль/л, а в крови больных с ожогами - 0,3-0,4 ммоль/л.^8,14,15 Из-за высокой скорости утилизации глутамина в тканях максимальная концентрация этой аминокислоты в крови, достигаемая при пероральном или парентеральном питании, лишь в пару раз превышает ее нормальный уровень,^8,14-16 и эта концентрация может быть наибольшей, действующей на нейтрофилы. Однако концентрация глутамина в зоне микроокружения клеток неизвестна.

Таблица 2.
Влияние глутамина на экспрессию рецептора CR1 и фагоцитарную активность нейтрофилов здоровых доноров и пациентов с ожогами

Степень вызываемого глутамином усиления бактерицидной активности значительно различалась у разных здоровых доноров, а у пациентов колебалась в зависимости от срока ожога. На эти индивидуальные различия активности нейтрофилов у здоровых доноров уже обращалось внимание в публикациях нашей лаборатории.^9,17 У некоторых больных глутамин лишь частично восстанавливал бактерицидную активность нейтрофилов, и во многих случаях, когда исходный ИБА был высоким, даже усиленная глутамином активность считалась умеренно или сильно нарушенной. Неспособность глутамина улучшать бактерицидную активность ПМК больных с ожогами во все сроки после ожога может объясняться многофакторной причиной нарушения этой функции, и не все эти факторы чувствительны к действию глутамина. Предварительная обработка нейтрофилов здоровых доноров ФМЛФ вызывала угнетение их бактерицидной активности; клетки, обработанные таким образом, находятся в частично угнетенном состоянии, напоминающем их состояние после термического повреждения. Глутамин частично восстанавливал эту сниженную бактерицидную активность, но не усиливал ее выше нормального уровня; таким образом, ФМЛФ не повышает чувствительности нейтрофилов к вызываемому глутамином усилению бактерицидной активности, а ФМЛФ и глутамин не оказывают синергического действия по этому показателю.

Бактерицидная активность нейтрофилов пациентов после ожога циклически колебалась, что наблюдалось и в предыдущих работах.^8,18 Кроме того, у некоторых больных в процессе госпитализации периодически наблюдались эпизоды сепсиса, однако у небольшого количества длительно наблюдавшихся нами больных не выявлено корреляции между величиной ИБА и эпизодами сепсиса.

Механизм вызываемого глутамином усиления бактерицидной активности нейтрофилов неизвестен. Глицин не влиял на бактерицидную активность клеток, таким образом, этот эффект глутамина не связан с неспецифическим усилением синтеза глюкозы. Эффект глутамина может проявляться на уровне процессов дегрануляции, образования супероксидных радикалов и других продуктов перекисного окисления, либо образования энергии, причем последний механизм хорошо описан для эффекта глутамина в других клетках иммунной системы. Однако мы не смогли обнаружить существенного захвата глутамина в нейтрофилы из инкубационной среды. Возможно, что использованный нами миллимолярный диапазон концентраций глутамина оказался слишком большим для выявления метаболизма этой аминокислоты за короткий промежуток времени.

Хотя имеются сообщения о том, что глутамин усиливает фагоцитоз макрофагами опсонизированных эритроцитов барана,² в нашей работе эта аминокислота существенно не усиливала фагоцитарной активности нейтрофилов здоровых доноров и пациентов (за исключением 1 больного) и экспрессию рецептора CR1 в этих клетках. Кроме того, глутамин не усиливал чувствительности нейтрофилов к вызываемой ФМЛФ повышающей активации рецепторов CR1 и усилению фагоцитарной активности, и наоборот, ФМЛФ не усиливал чувствительности клеток к действию глутамина. Таким образом, глутамин и ФМЛФ не оказывали синергического действия по этим показателям.

Такие вещества, как ФМЛФ, и такие воздействия, как ожог, могут тормозить бактерицидную активность нейтрофилов и в то же время вызывать повышающую регуляцию рецептора CR1 и торможение или усиление фагоцитоза. Следовательно, в таком состоянии нейтрофилы имеют высокий индекс ИБА и высокую экспрессию CR1 (и, возможно, фагоцитарную активность), в то время как в норме эти показатели имеют низкие значения. Отсутствие корреляции между величиной ИБА и экспрессией рецептора CR1 и активностью фагоцитоза в течение 4 из 5 недель наблюдения за двумя больными, у которых эти показатели измерялись, позволяет предположить, что причины повышающей регуляции рецептора CR1, усиления фагоцитарной активности и частичного нарушения бактерицидной активности нейтрофилов больных с ожогами могут быть разными, либо что больные по-разному реагируют на воздействия веществ в разные сроки после ожога. Опять-таки, следует подчеркнуть значительные межиндивидуальные различия и индивидуальные колебания реакций клеток на воздействие вещества или повреждающего фактора.

Глутамин стандартно добавляют в культуральные среды для усиления пролиферации клеток, и в настоящее время его испытывают в качестве компонента перорального и парентерального питания. Результаты данного исследования подтверждают благоприятное влияние глутамина по крайней мере на один компонент иммунной системы и дают дополнительные доказательства возможного преимущества добавления этой аминокислоты в диету больных с ожогами и другими травмами.

Комментарии