Вирусная нагрузка и тяжесть заболевания гепатитом C: есть ли связь?
Статьи Опубликовано в:Вирусные гепатиты: Достижения и перспективы
Информационный бюллетень
Е.И. Лакина, О.В. Масалова, А.А. Абдулмеджидова, А.А. Кущ,
НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН, Москва
Вирусный гепатит С является одной из главных причин хронических заболеваний печени. Первичная диагностика гепатита С осуществляется путем определения антител к белкам вируса гепатита С (ВГС) в сыворотках с использованием широко представленных на рынке тест-систем для иммуноферментного анализа (ИФА). Положительные результаты, полученные при скрининге сывороток, несут информацию о самом факте инфицирования, однако серологические методы не позволяют разграничить разрешившуюся острую инфекцию от хронического заболевания, а также оценить эффективность антивирусной терапии. В связи с этим для установления диагноза и характеристики активности хронического гепатита наряду с комплексным клиническим обследованием пациентов проводятся вирусологические исследования, направленные на определение прямых маркеров ВГС - РНК и вирусспецифических белков.
Патогенез гепатита С остается во многом неясным. До сих пор не существует однозначного ответа на вопрос, как присутствие вируса в организме влияет на развитие заболевания. Во многом это обусловлено тем, что исследователи этой проблемы получают противоречивые результаты. В этом обзоре мы постарались коротко изложить существующие в настоящее время опубликованные данные и результаты собственных исследований, касающиеся связи между присутствием РНК и белков ВГС в организме больных и активностью хронического гепатита С.
Для изучения распределения РНК вируса гепатита С в различных органах и тканях инфицированного организма применяют методы полимеразной цепной реакции с этапом обратной транскрипции (ОТ-ПЦР), гибридизации in situ, ПЦР in situ. Вирусные белки выявляют либо с помощью поликлональных сывороток, либо с помощью моноклональных антител.
Для оценки влияния вирусной нагрузки на активность хронического гепатита С, которая может варьировать от минимальных гистологических изменений в печени до случаев цирроза и гепатокарциномы, используют различные варианты количественного и полуколичественного методов ОТПЦР. Активность патологического процесса в печени оценивают по уровню активности фермента аланинаминотрансферазы (АЛТ), индексу гистологической активности (ИГА). Стадию заболевания характеризуют, используя гистологический индекс склероза (ГИС). Гистологический диагноз (ИГА и ГИС) ставится на основании морфологического изучения биопсийного материала печени и выражается в баллах в соответствии с международной классификацией (DesmetV.J. et al., 1994).
По данным ряда исследователей, репликация вируса возрастает по мере прогрессирования болезни (Cho S.W. et al., 1996), и более высокий уровень виремии коррелирует с более серьезным повреждением печени (Gretch D. et al., 1994). При исследовании парафиновых срезов печени Dries V. с соавт. (1999) отмечали более частое выявление РНК В ГС в печени пациентов с высоким уровнем воспалительной активности по сравнению со случаями, при которых повреждения печени были минимальны. По мнению авторов, это связано с тем, что вирусная нагрузка клеток печени может определять воспалительно-некротическую реакцию (Dries V. et al., 1999). По данным Jamal M.M. с соавт. (1999), у пациентов с постоянно нормальным уровнем АЛТ наблюдается значительно более низкий уровень РНК ВГС в печени, чем у больных с повышенным уровнем АЛТ. Adinolfi L.E. с соавт. (1998) указывают, что у пациентов с циррозом печени уровень РНК в печени превышает таковой у пациентов с низким уровнем ИГА (1-4). Наиболее высокий уровень РНК ВГС в печени наблюдается у больных с ИГА>8 (Adinolfi L.E.etal., 1998).
В противоположность этому большинство исследователей сходятся на том, что прямая связь между количеством РНК ВГС в организме (как в печени, так и в периферической крови) и степенью активности патологического процесса отсутствует (BallardiniG.etal., 1997, McGuinnesP.H. et al., 1996, Negro F. et al., 1998, 1999, Rodriguez-Inigo E.et al., 1999, Sugano M. et al., 1995). Поданным этих авторов, присутствие вируса в организме и уровень вирусной РНК не коррелируют со значениями ИГА, ГИС или АЛТ. Есть данные об уменьшении уровня вирусной РНК в печени при прогрессировании хронического гепатита С (Di MartinoetaL, 1997).
Результаты, полученные в нашей лаборатории, согласуются с последней концепцией: при исследовании материалов (ткани печени, сыворотки и лимфоцитов периферической крови) от 75 пациентов с хроническим гепатитом С не было обнаружено достоверных отличий между частотой выявления РНК ВГС у больных с различной активностью заболевания (Лакина Е.И. и др., 2000). При проведении нами количественного анализа уровня РНК ВГС в сыворотке крови больных ХГС (Amplicor Monitor Test, v.2.0., "Roche Diagnostics") также не выявлено значимой корреляции между показателями ИГА, ГИС, АЛТ и уровнем виремии.
В настоящее время в литературе активно обсуждается вопрос о роли лимфоцитов в развитии ВГС-инфекции. Результаты выявления РНК ВГС в мононуклеарах периферической крови больных гепатитом С, полученные разными исследователями, варьируют в широких пределах. Так, по данным одних авторов, РНК ВГС в мононуклеарах периферической крови встречается у 24% больных (Young K.S. et al., 1993), по данным других - у всех (100%) обследованных (MellorG. et al., 1998, OkumuraA. et al., 1998). Согласно нашим данным, РНК ВГС в лимфоцитах периферической крови выявляется в 64% случаев. Связи между наличием ВГС в лимфоцитах и активностью гепатита С не обнаружено.
Zignego A.L. с соавт. (1995) показали, что РНК вируса чаще встречается в клетках крови пациентов с более серьезными повреждениями печени. Для объяснения существования этой связи авторы предположили, что активная инфекция различных субпопуляций клеток, вовлеченных в иммунный ответ хозяина, может нарушать их функцию, приводя к персистенции ВГС и развитию хронических повреждений печени. Частое обнаружение РНК ВГС в периферических мононуклеарах больных с хроническими повреждениями печени может объясняться тем, что при длительной ВГС-инфекции клеток печени происходит увеличение пула инфицированных лимфоидных клеток путем передачи от клетки к клетке (Zignego et al., 1995). Показано, что инфицированные лимфоидные клетки могут быть причиной заражения здоровой печени, пересаженной в организм ВГС-инфицированного пациента (Feray С. et al., 1992). Внепеченочный резервуар инфекции может также служить источником реактивации болезни после прекращения интерферонотерапии (Gil В. et al., 1993).
При изучении вопроса о том, насколько уровень вируса в сыворотке отражает его количество в печени, данные исследователей расходятся. Тогда как одни авторы выявляют корреляцию между присутствием геномной РНК в печени и уровнем виремии (De Moliner L. et al., 1998, Mc Guinnes P.H. et al., 1996, Negro F. et al., 1999), другие (Ballardini G. et al., 1997) подобную связь отрицают. Martin с соавт. (1998) указывают на существование корреляции между количеством РНК ВГС в печени и в сыворотке крови, но не в периферических мононуклеарах. В работе Sugano M. с соавт. (1995) сообщается о положительной корреляции между уровнем РНК ВГС в печени и сыворотке крови до лечения интерфероном. После интерферонотерапии корреляция между количеством РНК в печени и в сыворотке не была обнаружена. Подсчет инфицированных клеток в печени после проведения гибридизации in situ показал, что число клеток, содержащих РНК ВГС, может колебаться от 4,8% до 87,6% у разных больных, и уровень виремии прямо зависит от числа инфицированных клеток в печени (Gosalvez J. et al., 1998, Lau G.K.K. et al., 1994, Rodriguez-Inigo E. et al., 1999). При сопоставлении частоты выявления РНК ВГС в печени и в сыворотке крови нами были получены результаты, согласно которым примерно в трети случаев возникает ситуация, когда при наличии вируса в печени РНК ВГС в сыворотке не выявляется: частота выявления РНК ВГС в печени составляет 86%, в сыворотке крови -51%. Эти результаты согласуются с данными других авторов (Haydon G.H. et al.„ 1998, Seidi S. et al., 1999). Например, в работе Haydon G.H. с соавт. (1998) геномная РНК ВГС выявлена в клетках печени 10 из 12 пациентов, негативных по этому показателю в сыворотке.
Жизненный цикл ВГС включает образование репликативных (минус-) цепей РНК, которые служат матрицей для образования геномных молекул. Частота выявления репликативной формы РНК ВГС по данным одних исследователей составляет 35% случаев (Gastaldi M. et al., 1995), тогда как по данным других до 100% (Okabe M. et al., 1997, Sansonno D. et al., 1997, Chang M. et al., 2000). Существенное расхождение данных может объясняться трудностями, возникающими при определении минус-РНК, так как количество негативных цепей РНК на один (lanford R.E. et al., 1995) - три (Mellor J. et al., 1998) порядка ниже, чем +РНК. Это объясняется тем, что одна молекула -РНК может служить матрицей для синтеза нескольких геномных молекул.
Среди исследователей нет единого мнения о том, насколько репликация вируса связана с процессами повреждения печени и выходом вирусных частиц в периферическую кровь (De Moliner L. et al., 1998. Negro F. et al., 1999). По данным Negro F. с соавт. (1998, 1999), использовавших полуколичественный метод PCR, нет строгой связи между вирусной репликацией и уровнем виремии. Согласно полученным нами данным, репликация вируса в печени сопровождается большей частотой выявления РНК ВГС в сыворотке крови, однако достоверной корреляции между этими параметрами не обнаружено. Несоответствие между количеством выявленных геномной и репликативной форм РНК ВГС в печени и уровнем виремии может быть следствием ряда причин: 1 - элиминации вируса из сыворотки с помощью специфических антител; 2 - поступления ВГС в периферическую кровь не только из печени, но и из других органов и тканей; 3 - нарушения процесса высвобождения вируса из клеток печени под действием лекарственных средств или других факторов (Negro F. et al., 1998). Опыты, проведенные в нашей лаборатории, не выявили достоверной корреляции между частотой встречаемости минус-РНК ВГС в печени и степенью поражения печеночной ткани (Лакина Е.И. и др., 2000). Это согласуется с предположением, что вирус может реплицироваться, не вызывая серьезных повреждений в ткани печени (Negro F. et al., 1998). Однако есть данные о возможном участии вирусной репликации в развитии цитопатического эффекта (Chang M. et al., 2000, Tsutsumi M. et al., 1994). С помощью метода гибридизации in situ показано, что клетки, содержащие репликативную форму РНК вируса, локализованы преимущественно в очагах поражения печени (Tsutsumi M. et al., 1994). Обнаружена достоверная корреляция между количеством гепатоцитов, содержащих репликативную форму РНК ВГС, и степенью воспаления печени. Следует отметить, что для геномной РНК ВГС авторы такой связи не выявили (Chang M. et al., 2000).
Согласно мнению большинства исследователей, хотя печень и является главным органом, где происходит вирусная репликация, ВГС может реплицироваться в периферических мононуклеарах, лимфатических узлах, поджелудочной железе, в меньшей степени - в костном мозге, селезенке, щитовидной железе и надпочечниках (Lerat Н. et al., 1996, Okumura A. et al., 1998, Gowans E.J., 2000, Grovatto M. et al., 2000, Radkoowski M. et al., 2000).
Наряду с определением РНК, перспективным методом изучения активности вирусной репродукции является выявление вирусных белков непосредственно в тканях с помощью иммуногистохимических методов (ИГХ). В качестве иммунных реагентов для детекции антигенов ВГС используются как моноклональные антитела (Ballardini G. et al., 1995, Gonzalez-Peralta R.P. et al., 1994, Noun-Aria K.T et al., 1995, Sansonno D. et al., 1995, Nayak N.C., SatharS.A., 1999), так и поликлональные антисыворотки, полученные от экспериментально иммунизированных животных (Gonzalez-Peralta R.P. et al., 1994, Tsutsumi M. et al., 1994) или больных хроническим гепатитом С людей (Ballardini G. et al., 1995, Nouri-Aria K.T. et al., 1995).
Большой интерес представляет вопрос о связи экспрессии вирусных белков с активностью патологических процессов в печени. Согласно большинству исследований, число гепатоцитов, содержащих вирусные антигены, не коррелирует ни со степенью гистологических изменений в печени, ни с показателями биохимической активности (Gonzalez-Peralta R.P. et al., 1994, Nayak N.C., Sathar S.A., 1999, Gowans E.J., 2000). С другой стороны, Hiramatsu N. с соавт. (1992) показали, что экспрессия антигенов ВГС в печени возрастала с увеличением степени поражения органа. Sansonno D., Damacco F. (1993), изучая печень больных острым гепатитом С, обнаружили топографическую связь между очагами воспаления и некроза с одной стороны и гепатоцитами, экспрессирующими антигены ВГС, - с другой. Однако при переходе болезни в хроническое состояние эта связь не обнаруживалась.
Мы изучали распределение антигенов нуклеокапсида, неструктурных белков NS3, NS4A и NS4B с помощью полученных нами МКА в клетках печени больных хроническим гепатитом С на криостатных срезах печени. Были использованы биопсийные материалы от больных с различной активностью гепатита С и на разных стадиях заболевания. Параллельно ткань печени анализировали методом RT-PCR на наличие геномной и репликативной цепей РНК ВГС. В целом, антигены ВГС обнаружены в печени 33 из 34 (97%) пациентов, имеющих геномную РНК в ткани печени. Уровень детекции белка нуклеокапсида составлял 53%, NS3 - 76%, NS4 - 81%. Репликативная форма РНК ВГС значительно чаще ассоциировалась с выявлением соrе-белка. При этом доля антиген-позитивных гепатоцитов варьировала в широких пределах от 1 до 90% у разных пациентов, составляя в среднем около 32%. У больных с ХГС обнаружены качественные и количественные различия в соотношении структурных и неструктурных белков ВГС в клетках печени. В целом, все исследованные белки накапливались в печени пациентов с более тяжелыми формами ХГС (Абдулмеджидова АГ. и др., 2000). Между антиген-содержащими клетками и очагами воспаления и некроза ткани печени топографической связи выявлено не было, что подтверждает ранее полученные данные (Sansonno D., Damacco F., 1993). Эти результаты свидетельствуют в пользу гипотезы об отсутствии прямого цитопатического действия ВГС.
Анализ внутриклеточной локализации вирусных белков методом ИГХ показал, что специфическое окрашивание наблюдается только в цитоплазме гепатоцитов, что согласуется с большинством опубликованных работ (Ballardini G. et al., 1997, Blight К. et al., 1994, Brody R.I. et al., 1998, Gonzalez-Peralta et al., 1994, 1995, Nouri-Aria K.T. et al., 1995, Sansonno D. et al., 1995 (a,b), 1997).
Большой интерес представляет использование моноклональных антител для выявления белка нуклеокапсида ВГС в сыворотках крови больных гепатитом С и доноров (Onto E. et al., 1996, Jolivet-Reynaud С. et al., 1998, Masalova O.V. et al., 1998). Подобные исследования наталкиваются на две основные трудности: низкая концентрация вируса и блокирование антигенов ВГС антителами в составе иммунных комплексов (Onto E. et al., 1996, Shiratori Y. et al., 1997). В нашей лаборатории разработан метод для количественного определения соге-белка, входящего в состав циркулирующих в плазме "свободных" вирионов и иммунных комплексов. При исследовании плазм от 80 антиВГС-позитивных доноров оказалось, что вирусная РНК выявляется только в половине образцов. В 94,4% РНК-позитивных плазм выявлен и белок нуклеокапсида ВГС. Концентрация белка core в разных образцах варьировала в широких пределах и составляла 5-850 пг/мл (Масалова О.В. и др., 2000). В сыворотках пациентов с ХГС (n=71) белок нуклеокапсида был обнаружен у 74% больных. Концентрация соге-белка не коррелировала с тяжестью заболевания Показано, что циркуляция ВГС в виде иммунных комплексов ассоциирована с более продвинутой стадией ХГС (согласно значениям ГИС) (Masalova O.V. et al., 2000). Тест-системы для ИФА на основе моноклональных антител, позволяющие определять белок нуклеокапсида не только на качественном, но и на количественном уровне, являются более простым и дешевым, чем ПЦР, методом выявления ВГС. Их внедрение в практику здравоохранения может существенно обогатить возможности современной диагностики и контроля за течением гепатита С.
Таким образом, несмотря на десятилетнее изучение вопроса о связи между присутствием вируса гепатита С в организме и прогрессированием хронического гепатита, многое по-прежнему остается неясным. Данные о роли вирусного генома и вирусных белков в патогенезе инфекции противоречивы. Необходимы дальнейшие исследования по комплексному анализу обоих компонентов иммунного распознавания: вируса (РНК, структурных и неструктурных белков) и иммунной системы хозяина (антител к ВГС, Т-клеток, цитокинов и иммунных комплексов). Эти знания необходимы для разработки эффективных средств профилактики и специфических препаратов для лечения гепатита С, что позволит контролировать это широко распространенное тяжелое заболевание человека.
* Работа поддержана РФФИ, проект № 01-04-48890
Литература:
1. Абдулмеджидова А.Г, Лакина Е.И., Масалова О.В. и др. Изучение структурных и неструктурных белков вируса гепатита С (В ГС) в клетках печени пациентов с хроническим гепатитом С // В сб. "Гепатит С (Российский консенсус)". - Москва. - 2000.
2. Лакина Е.И., Самохвалов Е.И., Левченко О.Г. и др. Выявление позитивных (геномных) и негативных (репликативных) цепей РНК вируса гепатита С в сыворотке крови, лимфоцитах и ткани печени больных хроническим гепатитом С с помощью полимеразной цепной реакции // Вопр. вирусол. - 2000. - N4. - С. 37-41.
3. Масалова О.В., Самохвалов Е.И., Петракова Н.В. и др. Выявление маркеров вируса гепатита С - белка нуклеокапсида, РНК и вирусспецифических антител в плазмах крови доноров // Вопр. вирусол. - 2000. - N2. - С. 14-18. 4. Adinolfi L.E., AndreanaA., Utili R. et al. HCV RNA levels
in serum, liver, and peripheral blood mononuclear cells of chronic hepatitis С patients and their relationship to liver injury//Am. J. Gastroenterol. -1998. - V.93. - Nll.- P.2162-2166.
5. Ballardini G., Groff P., Giostra F. et al. Hepatocellular codistribution of C100, СЗЗ, С22, and NS5 hepatitis С virus antigens detected by using immunopurified polyclonal spontaneous human antibodies. // Hepatology. - 1995. - V. 21. -P.730-734.
6. Ballardini G., Manzin A., Giostra F. et al. Quantitative liver parametrs of HCV infection - relation to HCV genotypes, viremia and response to interferon treatment / / J. Hepatology. - 1997. - V.26. - N4. - P.779-786.
7. Blight K., Lesniewski R.R., Labrooy J.T, Gowans E.J. Detection and distribution of hepatitis C-specific antigens in naturally infected liver. // Hepatology. - 1994. - V. 20. - P. 553-557.
8. Brody R.I., Eng S., Melamed J. et al. Immunohistochemical detection of hepatitis С antigen by monoclonal antibody TORDJI-22 compared with PCR viral detection. //Am. J. Clin. Pathol. -1998. - V.110. - Nl. -P.32-37.
9. Chamlian A., Benkoel L., Sahel J. et al. Immunohistochemical detection of hepatitis С virus related С 100-3 and core antigens in formalin-fixed liver tissue. // Cell.Molec. Biology - 1996. - V. 42. - P. 557-566.
10. Chang M., MarquardtA-P, Wood B.L. et al. In situ distribution of hepatitis С virus replicative-intermediate RNA in hepatic tissue and its correlation with liver disease // J. Virol.-2000. - V.74. - N2. - P.944-955.
11. Cho S.W., Hwang S.G., Han D.S. et al. In situ detection of hepatitis С virus RNA in liver tissue using a digoxigenin-labeled probe created during a polimerase chain reaction / / J. Med. Virol. - 1996. - V.48. - N3. - P.327-333.
12. Dash S., Saxena R., Myung J. et al. HCV RNA levels in hepatocellular carcinomas and adjacent non-tumorous livers. //J. Virol. Meth. - 2000. - V.90. - Nl. - P. 15-23.
13. De Moliner L., Pontisso P., De Salvo G.L. et al. Serum and liver HCV RNA levels in patients with chronic hepatitis C: correlation with clinical and histological features // Gut. -1998.-V.42.-N5.-P.856-860.
14. Desmet V.J., Gerber M., Hoofnagle J.H. et al. Classification of chronic hepatitis: diagnosis, grading and staging. // Hepatology -1994. - V.I 9. - P. 1513-1520.
15. Di Martino V., Saurini F., Samuel D. et al. Long-term longitudinal study of intrahepatic hepatitis С virus replication after liver transplantation//Hepatology- 1997. -V.26. - N5. -P. 1343-1350.
16. Doughty A.L., Painter D.M., McCaughan G.W. Nonspecificity of monoclonal antibody Tordji-22 for the detection of hepatitis С virus in liver transplantant recipients with cholestatic hepatitis. // Liver Transpl. Surg. - 1999. -V. -N1.-P.40-45.
17. Dries V., von Both I., Muller M. et al. Detection of hepatitis С virus in paraffin-embedded liver biopsies of patients negative for viral RNA in serum//Hepatology. -1999. - V.28. - Nl. -P.223-229.
18. Feray C., Samuel D., Thiers V. et al. Reinfection of liver graft by hepatitis C virus after liver transplantation. // J. Clin. Invest. - 1992. - V.89. -P. 1361-1366.
19. Gastaldi M., MassacrierA., Plannels R. et al. Detection by in situ gybridization of hepatitis C virus positive and negative RNA strands using digoxigenin-labeled cDNA probes in human liver cells // J. Hepatol. - 1995. - V.23. - N5. - P.509-518.
20. Gil В., Quian C., Riezu-Boj J.I. et al. Hepatic and extra-hepatic HCV RNA strands in chronic hepatitis C: different patterns of response to interferon treatment. // Hepatology -1993.-V.18.-P. 1050-1054.
21. Gonzalez-Peralta R. P., Fang J. W., Davis G. L. et al. Optimization for the detection of hepatitis C virus antigens in the liver. // J. Hepatol. -1994. - V. 20. - P. 143-147.
22. Gosalvez J., Rodriguez-Inigo E., Ramiro-Dias J. et al. Relative quantification and mapping of hepatitis C virus by in situ hybridization and digital image analysis // Hepatology. -1998.- V.27.-N5.-P.1428-1434.
23. Gowans E.J. Distribution of markers of hepatitis C virus infection throughout the body. // Semin. Liver Dis. - 2000. -V.20.-N1.-P.85-102.
24. Gretch D., Corey L., WilsonJ. et al. Acessment of hepatitis C virus RNA levels by quantitative competitive RNA polymerase chain reaction: high-titer viremia correlates with advanced stage of disease // J. Infect. Dis. - 1994. - V.I 69. -P.1219-1225.
25. Grovatto M., Pozzato S., Zorat F. et al. Peripheral blood neutrophils from hepatitis C virus infected patients are replication sites of the virus. // Haemotologica. - 2000. - V.85. - N4. -P.356-361.
26. Hiramatsu N., Hayashi N., Hurana Y. et al. Immunohistochemical detection of hepatitis C virus-infected hepatocytes in chronic liver disease with monoclonal antibodies to core, envelope and NS3 regions of the hepatitis C virus genome. // Hepatology -1992. - V. 16. - N3. - P. 306- 311.
27. Jamal M.M., Soni A., Quinn P.G. et al. Clinical features of hepatitis C-infected patients with persistently normal alanine transaminase levels in the Southwesten United States // Hepatology. - 1999. - V.30. - N5. - P.1307-1311.
28. Jolivet-Reynaud C., Dalbon P., Viola F. et al. HCV core immunodominant region analysis using mouse monoclonal antibodies and human sera: characterization of major epitopes useful for antigen detection. // J. Med. Virol. - 1998. - V.56. -N4. - P.300-309.
29. Komminoth P., Adams V, Long A. et al. Evaluation of methods for hepatitis C virus detection in archival liver biopsies. Comparison of histology, immunihistochemistry, in situ hibridization, reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) and in situ RT-PCR. // Pathol. Res. Pract. - 1994. -V.190.-P.1017-1025.
30. Lam N.P. Hepatitis C: natural history, diagnosis, and management.//Am. J. Health.Syst.Pharm.-1999.-V.56.-N10. -P.961-973.
31. Lanford R.E., Chaves D., Chisari F.V, Sureau C. Lack of detection of negative-strand hepatitis с virus RNA in peripheral blood mononuclear cells and other extrahepatic tissues by the highly strand-specific rTth reverse transcriptase PCR. // J. Virol. - 1995. - V.69. - N12. - P.8079-8083.
32. Laskus Т., Radkowski M., Wang L.F. et al. Uneven distribution of hepatitis C virus C quasi-species in tissues from subjects with end-stage liver disease - confounding effect of viral adsorption and mounting evidence for the presence of low-level extrahepatic replication. // J. Virol. - 2000. - V.74. - N2. -P.1014-1017.
33. Lau G.K.K., Fang J.V.C., Wu P.S. et al. Detection of hepatitis C virus genome in formalin-fixed parafin-embedded liver tissue by in situ reverse transcription polymerase chane reaction // J. Med. Virol. -1994. - V.44. - N5. - P.406-409.
34. Lerat H., Berby F., Trabaud M.A. et al. Specific detection of hepatitis C minus strand RNA in hematopoetic cells. // J. Clin. Invest. -1996. - V.97. - N3. - P.845-851.
35. Martin J., Navas S., Quiroga J.A. et al. Quantification of hepatitis C virus in liver and peripheral blood mononuclear cells from patients with chronic hepatitis C virus infection // J. Med. Virol. - 1998. - V.54. - N4. - P.265-270.
36. Masalova O.V, Atanadze S.N., Samokhvalov E.I. et al. Detection of hepatitis C virus core protein circulating within different virus particle population. // J. Med. Virol.- 1998. -V.55.-P.1-6.
37. Masalova O.V, Vishnevskaya TV, Lakina E.I. et al. Quantitative detection of hepatitis C core protein circulating within virions and immune complexes in serum of HCV-infected patients. // J. Clin. Virol. - 2000. - V.18. - N.1-3. -P.81-82.
38. Mc Guinnes PH., Bishop G.A., Painter D.M., Chan R. Intrahepatic hepatitis C RNA levels do not correlate with degree of liver injury in patients with chronic hepatitis С // Hepatology - 1996. - V.23. - N4. - P.676-687.
39. Mellor J., Haydon G., Blair C. et al. Low level or absent in vivo replication of hepatitis C virus and hepatitis G virus / GB virus C in peripheral blood mononuclear cells. // J. Gen. Virol. -1998. - V.79. - N4. - P.705-714.
40. Muratori B.L., Gibellini D., Lenzi M. et al. Quantification of hepatitis C virus infected peripheral blood mononuclear cells by in situ reverse transcriptase chain reaction. // Blood. -1996. - V.88. - N7. - P.2768-2774.
41. Nayak N.C., Sathar S.A. Immunohistochemical detection of hepatitis C virus antigen in paraffin embedded liver biopsies from patients with chronic liver disease. // Acta Histochem. - 1999.-V.101.-N4.-P.409-419.
42. Negro F, Giostra E., Krawczynski K. et al. Detection of intrahepatic hepatitis С virus replication by strand-specific semi-quantitative RT-PCR: preliminary application to the liver transplantation model //J. Hepatol. -1998. - V.29. - P.l-11.
43. Negro F., Krawczynski K., Quadri R. et al. Detection of genomic- and minus-strand of hepatitis С virus RNA in the liver of chronic hepatitis С patients by strand-specific semi-quantitative reverse-transcriptase polymerase chain reaction // Hepatology. - 1999. - V.29. - P.536-542.
44. Nouri Aria K.T, Sallie R., Sangar D. et al. Detection of genomic and intermediate replicative strands of hepatitis С virus in liver tissue by in situ hybridization // J. Clin. Invest. -1993. - V.91. - N5. - P.2226-2234.
45. Nouri-Aria K.T, Sallie R., Mizokami M. et al. Intrahepatic expression of hepatitis С virus antigens in chronic liver disease. //J. Pathol. - 1995. - V.I 75. - P.77-83.
46. Okabe M., Fukuda K., Arakawa K., Kikuchi M. Chronic variant of myocarditis associated with hepatitis С virus infection // Circulation. - 1997. - V.96. - N1. - P.22-24.
47. OkumuraA., Yoshioka K., AiyamaT. et al. Different constitution of hepatitis С virus population in peripheral blood mononuclear cells and plasma in patients with type С chronic liverdisease. // Dig. Dis. Sci. -1998. - V.43. - N2. - P.377-383.
48. Onto E., Mizokavi M., Tanaka T. et al. Quantification of serum hepatitis С virus core protein level in patients chronically infected with different hepatitis С genotypes. // Gut. -1996.-V.39.-P.876-880.
49. Sansonno D., Dammacco F. Hepatitis С virus с 100 antigen in liver tissue from patients with acute and chronic infection. //Hepatology. - 1993.-V.18. - P.240-245.
50. Sansonno D., Comacchiulo V, lacobelli A.R. et al. Localization of hepatitis С virus antigens in liver and skin tissues of chronic hepatitis С virus-infected patients with mixed cryoglobulinemia. // Hepatology. - 1995. - V.21. - P.305-312.
51. Sansonno D., lacobelli A.R., Comacchiulo V. et al. Immunohistochemical detection of hepatitis С virus-related proteins in liver tissues. // Clin. Exp. Rheumatol. - 1995. -V.13.-S29-S32.
52. Sansonno D., Comacchiulo V, Racanelli V, Damacco F. Insimultaneous detection of hepatitis С virus RNA and hepatitis С virus-related antigenes in hepatocellular carcinoma // Cancer. -1997. - V.80. - N1. - P.22-33.
53. Seidi S., Koenig В., Reinhardt G. et al. Higher detection rate of hepatitis G and С virus RNA in liver tissue than in serum of deceased injection drug users // Int. J. Legal. Med. -1999.-V.112.-N1.-P.35-38.
54. Shiratori Y., Kato N.. Yokosuka O. et al. Quantitative assays for hepatitis С virus in serum as predictors of long-term response to interferon. // J. Hepatol. - 1997. - V.27. - P.437-444.
55. Sugano M., Hayashi J., Joon S. et al. Quantification of hepatitis С viral RNA in liver and serum samples using competitive polymerase chain reaction//J. Clin. Pathol. - 1995. -V.48. - N8. -P.820-825.
56. Radkowski M., Kubicka J., Kisiel E. et al. Detection of active hepatitis С vims and hepatitis G virus/GB virus С replication in bone marrow in human subjects. // Blood. - 2000. -V.95.-N12.-P.3986-3989.
57. Rodriguez-Inigo E., Bartolome J., de Lucas S. et al. Histological damage in chronic hepatitis С is not related to the extent of infection in the liver//Am. J. Pathol. - 1999. - V.I 54. -N6.-P.1877-1881.
58. Tsutsumi M., Urashima S., Takada A. et al. Detection of antigens related to hepatitis С vims RNA encoding the NS5 region in the livers of patients with chronic type С hepatitis. // Hepatology. - 1994. - V.19. - N2. - P.773-778.
59. Walker F.M., Dazza M.L., Dauge M.C. et al. Detection and localization by in situ molecular biology techniques and immunohistochemistry of hepatitis С virus in livers of chronically infected patients. // J. Histochem. Cytochem. - 1998. -V.46. - N5. - P.653-660.
60. Young K.C., Chang T.T, Liou T.C., Wu H.L. Detection of hepatitis С vims RNA in peripheral blood mononuclear cells and in saliva. //J. Med. Virol. - 1993. - V.41. - Nl. - P.55-60.
61. Zignego A.L., De Carli M., Monti M. et al. Hepatitis С vims infection of mononuclear cells from peripheral blood and liver infiltrates in chronically infected patients. // J. Med. Virol. - 1995. - V.47. - P.58-64.
