Нейропротекторное действие препарата Mексидол при тотальной ишемии мозга (к вопросу о целесообразности применения данного препарата при гравитационных перегрузках)

Опубликовано в журнале:
Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2006, приложение 1

Л.М.Макарова Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

На модели тотальной ишемии мозга у крыс изучали нейропротекторную активность препарата "Мексидол" при гравитационных перегрузках в краниокаудальном положении. Установлено, что мексидол в дозах 5 и 20 мг/кг увеличивает выживаемость лабораторных животных при гипергравитации. Эффективность профилактического применения данного препарата обусловлена ограничением гипергликемии и лактат-ацидоза, процессов ПОЛ в мозге и в эритроцитах, уменьшением проницаемости мембран эритроцитов для ионов кальция, поддержанием реакции ауторегуляции церебральных сосудов.

Ключевые слова: мексидол, гипергравитация, мозг

В течение последних десятилетий активно изучается влияние гравитационных перегрузок на организм человека. Ввиду отсутствия надежных механизмов компенсации нарушений, вызванных действием гипергравитации с вектором "голова-таз", у летчиков возникает ряд профессиональных заболеваний (нарушение зрения, смещение внутренних органов, развиваются эндокринные и вегетативные расстройства) [10]. Гравитационные перегрузки действуют на организм летчиков в течение двух-трех десятилетий и могут способствовать развитию ряда патологических состояний, в том числе и сердечно-сосудистой системы. В связи с этим представляется актуальной разработка средств профилактики неблагоприятного воздействия гипергравитации на организм человека [7].

Мексидол - отечественный препарат нового поколения. Несмотря на широкий спектр показаний (применяется в неврологии, хирургии, психиатрии, кардиологии, наркологии, стоматологии, офтальмологии, эндокринологии и других областях клинической медицины), особую ценность данный препарат представляет как эффективный нейропротектор. Многочисленные клинические исследования подтверждают преимущества (в том числе и отсутствие привыкания) этого лекарственного средства перед другими препаратами, используемыми в неврологии. При гравитационных перегрузках прежде всего страдает головной мозг [2] - орган, наиболее чувствительный к дефициту кислорода и к окислительному стрессу [1,3,9,15].

Целью настоящего исследования явилась оценка эффективности профилактического применения мексидола в качестве средства коррекции метаболических и функциональных нарушений в мозге при воздействии гипергравитации.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты выполнены на 66 крысах-самцах Вистар массой 200-220 г. В работе использовали высокоустойчивых к гипоксическим факторам животных. Разделение крыс на низко- и высокоустойчивых проводили с помощью гипоксической пробы - поднятия на высоту 11 000 м над уровнем моря со скоростью 50 м/с. Высокоустойчивыми считали особей, у которых в течение 5 мин на заданной высоте отсутствовали признаки гипоксии (судороги, учащение дыхания).

Тотальную ишемию мозга моделировали с помощью гравитационных перегрузок в кранио-каудальном положении [2]. Проведенные исследования показали, что при моделировании гравитационных перегрузок в краниокаудальном направлении происходит снижение артериального давления в сонной артерии до 0 мм рт. ст., т.е. у животных имеет место тотальная ишемия мозга. Для моделирования гравитационных перегрузок использовали центрифугу диаметром 2 м. Бодрствующих крыс помещали в специальные контейнеры-пеналы, прикрепленные к концам рычагов центрифуги, и мощный двигатель в течение 10 с создавал необходимую степень гравитации.

На первом этапе работы выявляли наиболее эффективные дозы мексидола, способствующие увеличению выживаемости крыс при гипергравитации. Для этого животным внутрибрюшинно вводили мексидол в дозах 5, 10 и 100 мг/кг в течение 3 сут до моделирования патологии. Величину гравитационных перегрузок подбирали так, чтобы летальность животных в контрольной группе составляла не более 20% (21g в течение 12 мин). Градиент нарастания и спада нагрузки составлял 0.30-0.33 ЕД/с. Критерием нейропротекторного действия мексидола являлось увеличение выживания крыс опытной группы относительно контрольных животных.

На следующем этапе работы анализировали степень защитного действия мексидола в дозе 5 мг/кг при курсовом профилактическом введении у животных, подвергавшихся 3-кратным гравитационным перегрузкам, которые не приводили к летальному исходу в течение 10 мин, градиент нарастания и спада нагрузки - 0.30-0.33 ЕД/с). При исследовании механизма нейропротекторного действия мексидола препарат вводили за 7 дней до гравитационных перегрузок, затем вызывали гипергравитацию, а через 1 ч после перегрузок вводили мексидол. Данные манипуляции (гравитационные перегрузки и последующее введение мексидола) проводили 3 раза в течение 3 дней. В работе использовали мексидол (НПК "Фармасофт", партия № 002161/01-2003) в виде раствора для инъекций.

В экспериментах использовали животных 3 групп: интактных, контрольных (нелеченые) и подопытных (животные, получавшие мексидол). Интактные животные гравитационным перегрузкам не подвергались. Животным всех групп вводили эквивалентный объем жидкости (физиологический раствор - крысам интактной и контрольной групп, раствор мексидола - в опытной).

Материал для биохимических исследований (кровь и головной мозг) брали через 3 ч после моделирования последней гипергравитации под уретано-хлоралозным (10:1) наркозом в дозе 500 мг/кг. Артериальную кровь брали из сонной артерии, венозную - из сагиттального синуса. Диеновую конъюгацию (ДК) ненасыщенных жирных кислот в мозге определяли спектро-фотометрически по интенсивности поглощения гептано-изопропилового раствора в области 230 нм [5]. Концентрацию вторичных продуктов ПОЛ в мозге в пересчете на МДА определяли по тесту с ТБК. Структурно-функциональные свойства мембран эритроцитов оценивали по накоплению в них МДА [5]. Биоантиоксидантную защиту мозга оценивали по каталазной и СОД-активности [14]. Активность ферментов относили к содержанию общего белка в пробах. Об интенсивности гликолиза в эритроцитах судили по приросту лактата при инкубации суспензии эритроцитов в среде, содержавшей глюкозу [6]. Активность АТФазы эритроцитов определяли по приросту неорганического фосфора при инкубации в среде, содержавшей АТФ [8]. Результаты выражали в микрограммах неорганического фосфора на 1 мл эритроцитов при 37оС [12]. Фосфор неорганический и лактат определяли с помощью апробированных тест-наборов ("Olvex Diagnosticum"). Уровень пирувата оценивали спектрофотометрически в безбелковых пробах крови [12]. Концентрацию кальция и общего белка в сыворотке крови определяли с помощью наборов фирмы "Lachema". По артериовенозной разнице рассчитывали утилизацию глюкозы и лактата мозгом. Объемную скорость мозгового кровотока регистрировали методом водородного клиренса с помощью платинового электрода, расположенного на поверхности сагиттального синуса в области стока синусов. О характере цереброваскулярных реакций судили по показателям мозгового кровотока и сопротивления сосудов мозга при разных уровнях перфузионного давления, а также по коэффициенту ауторегуляции [13]. Системное артериальное давление (САД) измеряли в сонной артерии животных с помощью ртутного манометра.

Влияние мексидола на выживаемость оценивали у 12 животных из каждой группы. При изучении механизма действия мексидола при повторяющихся гравитационных перегрузках использовали по 6 животных разных групп.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием t критерия Стьюдента, критерия Вилкоксона-Манна-Уитни [11].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В контрольной группе животных выживаемость составила 16.3%. Профилактически введенный мексидол в дозах 5 и 20 мг/кг существенно повышал устойчивость животных к гипергравитации (до 50 и 58% соответственно; рис. 1). Эффективность препарата в этих дозах сопоставима, т.к. статистически значимого различия в выживаемости при их применении не выявлено. Мексидол в дозе 100 мг/кг не оказывал существенного влияния на выживаемость животных при гипергравитации. Результаты этого этапа эксперимента позволили провести углубленное фармакологическое исследование, целью которого явилось изучение эффективности профилактического применения мексидола в дозе 5 мг/кг при повторяющихся гравитационных перегрузках, не вызывающих летальных исходов. В этом случае менее выраженными были гипергликемия и лактат-ацидоз, зафиксированные в контрольной группе (табл. 1). У животных, не получавших мексидол (контроль), концентрация глюкозы в артериальной крови была на 33.3% выше, чем у интактных, а у крыс опытной группы данный показатель в среднем на 14.8% превышал таковой у интактных животных. Менее выраженное увеличение концентрации глюкозы в крови на фоне применения препарата свидетельствует о его положительном влиянии, т.к. показатель содержания глюкозы в крови отражает выраженность стресс-реакции [9]. Можно предположить, что мексидол ограничивает стрессогенное действие гипергравитации. Снижение гипергликемии у животных опытной группы, по-видимому, обусловлено нейротропными свойствами данного антиоксиданта [4]. Менее выраженное повышение уровня содержания глюкозы в крови под влиянием мексидола также свидетельствует о благоприятном действии препарата: гипергликемия является одним из факторов, активирующих процессы ПОЛ [15].

Рис. 1. Выживаемость животных при гипергравитации.
1 - контроль, 2 - мексидол 5 мг/кг, 3 - мексидол 20 мг/кг, 4 - мексидол 100 мг/кг. *p<0.05 по сравнению с контролем.

Таблица 1. Концентрация глюкозы, пирувата и лактата в крови крыс (M±m)

По сравнению с интактными животными у крыс контрольной группы утилизация глюкозы мозгом повысилась более чем в 2 раза (на 30.6%), также наблюдалась компенсаторная активация утилизации лактата (рис. 2). Интенсивную утилизацию лактата мозгом можно расценивать как компенсаторную реакцию, направленную на снижение постишемического ацидоза. Однако, несмотря на активацию глюконеогенеза, в контрольной группе отмечено развитие метаболического ацидоза (концентрация молочной кислоты на 70% превышала данный показатель у животных без патологии), свидетельствующее о замедлении аэробных метаболических процессов, в результате чего глюкоза распадается преимущественно по анаэробному пути [9]. О подавлении аэробиоза у животных контрольной группы свидетельствует существенное повышение уровня концентрации пирувата (более чем на 30% по сравнению с интактными крысами) в их венозной крови (табл. 1), что указывает на нарушения процессов аэробного гликолиза.

Рис. 2. Утилизация мозгом глюкозы и лактата. 1 - интактные животные, 2 - контрольные животные, 3 - животные, получавшие мексидол (5 мг/кг). p<0.05 по сравнению ⁺с интактными животными, *с контрольными животными.

Мексидол ограничивал не только постишемическую гипергликемию, но и лактат-ацидоз: у животных опытной группы концентрация молочной кислоты как в артериальной, так и в венозной пробе была значимо ниже, чем у контрольных (табл. 1). Под влиянием данного антиоксиданта наблюдалась более выраженная утилизация лактата мозгом (рис. 2). Таким образом, ограничение развития ацидоза под влиянием мексидола при гипергравитации обусловлено не только снижением выработки лактата, но и активацией его утилизации мозгом. Ограничение накопления молочной кислоты при применении мексидола следует рассматривать как один из доминирующих механизмов нейропротекторного действия препарата, т.к. ацидоз влияет на все уровни метаболизма нервной ткани и является важным повреждающим компонентом [15]. Снижение уровня рН усугубляет энергетические нарушения и нарушения ионного транспорта, глутаматную "эксайтотоксичность", катализирует свободнорадикальные реакции. Повреждение астроцитов при ацидозе также способствует некротизации нейронов: нарушает транспорт глутамата из синаптической щели и влияет на уровень "эксайтотоксичности" [3].

Одним из пусковых механизмов нарушения энергетического обмена мозга является активация свободнорадикального окисления и увеличение уровня содержания перекисных соединений липидов, что сопровождается подавлением антиоксидантной активности мозга [3,15].

Особое внимание нами уделено изучению влияния мексидола на процессы ПОЛ и активность ферментов антиоксидантной защиты. У животных контрольной группы зарегистрирован более низкий уровень содержания ТБК-активных продуктов, чем у интактных крыс (табл. 2). Данное обстоятельство можно объяснить тем, что, согласно учению Г.Селье, реакция живого организма на действие стрессора (в нашем случае - гипегравитации) реализуется в так называемом общем адаптационном синдроме, который имеет две разделенные во времени стадии адаптации - срочную и долговременную. Срочная стадия возникает непосредственно после начала действия раздражителя, реализуется на базе готовых, ранее сформировавшихся механизмов, но является несовершенной. В этот период деятельность организма происходит на пределе функциональных возможностей, требуется значительная мобилизация его резервов, но, как правило, при этом не удается обеспечить необходимый адаптационный эффект [15]. О наличии данного этапа адаптации у животных с ишемией мозга свидетельствовало снижение уровня содержания вторичных продуктов ПОЛ. При этом концентрация ДК более чем в 2 раза превышала таковую у интактных животных. Для более глубокой оценки влияния тотальной ишемии мозга, вызванной гипергравитацией, на процессы свободнорадикального окисления изучали активность ферментов антиоксидантной защиты - СОД и каталазы (табл. 3). У животных контрольной группы по сравнению с интактными крысами снизились активность СОД (на 53.3%) и активация каталазы (на 57.6%). Уменьшение степени активности фермента, обезвреживающего супероксидный радикал, и активация фермента, обезвреживающего H₂O₂, а также существенное повышение уровня концентрации ДК в гомогенатах мозга позволяют говорить о напряжении в системе антиоксидантной защиты и указывают на активацию свободнорадикальных процессов в мозге. Компенсаторное повышение активности каталазы не обеспечивает полноценную защиту клеток мозга от повреждающего действия чрезмерной активации ПОЛ. При курсовом введении мексидола концентрация первичных и вторичных продуктов ПОЛ в мозге была близка к таковой у интактных животных (табл. 2). Исследуемый антиоксидант не вызывал снижения активности СОД, наблюдавшегося у животных контрольной группы, а повышение активности каталазы под влиянием мексидола было менее выражено, чем у животных, не получавших данный препарат (табл. 2). Таким образом, мексидол препятствует повышению активности антиоксидантных ферментов, а несущественные изменения уровня концентрации ДК и ТБК-активных продуктов в мозге свидетельствуют о менее выраженном стрессогенном действии гравитации на животных, получавших данный препарат.

Таблица 2. Уровень содержания продуктов ПОЛ в мозге и активность ферментов антиоксидантной защиты у крыс (M±m)

Позитивным действием мексидола при гипергравитации следует считать существенное ингибирование аутоокисления адреналина (табл. 3), т.к. установлено, что высокая токсичность данного катехоламина обусловлена не только его действием, но и таковым его окисленной формы - адренохрома, превосходящего по своим токсическим свойствам даже адреналин [15]. Окисление катехоламинов происходит под влиянием суперокид-радикала, следовательно, результаты наших исследований также подтверждают, что мексидол существенно ограничивает образование данных реакционных соединений у животных, подвергавшихся гипергравитации.

Таблица 3. Влияние мексидола на аутоокисление адреналина, стабильность мембран эритроцитов и концентрацию иона кальция у крыс (M±m)

Реакция мембраны эритроцитов на гипоксический фактор проявляется снижением ее устойчивости, поэтому представляется целесообразным рассматривать воздействия этого лекарственного средства на стабильность эритроцитарной мембраны. Анализ результатов исследований, посвященных изучению влияния фармакологических агентов на свойства мембран эритроцитов, свидетельствует о том, что в большинстве случаев используется методика инкубации эритроцитов интактных животных с фармакологическими агентами. Нами использовались эритроциты не интактных крыс, а животных, которым курсовое введение мексидола проводилось на фоне гипергравитации, что позволило более объективно оценить влияние данного препарата на стабильность эритроцитов при моделировании перегрузок. Нами учитывалось, что эритроциты в условиях ишемии-реперфузии более чувствительны к окислительному стрессу и отвечают большим угнетением гликолитической энергопродукции [15].

Усиление процессов ПОЛ в мембранах эритроцитов, выявленное у животных контрольной группы, свидетельствует о наличии структурных изменений в клеточных мембранах. Экспериментально установлено, что курсовое применение мексидола препятствует образованию МДА в мембранах эритроцитов животных, подвергавшихся гравитационным перегрузкам (табл. 3). Подавление образования ТБК-активных продуктов в мембранах эритроцитов в опытной группе крыс позволяет предположить, что мексидол ограничивает не только нарушения структурной целостности мембран, но и нарушения энергетического обмена в эритроцитах животных, перенесших тотальную ишемию мозга. Результаты нашего исследования свидетельствуют о том, что мексидол поддерживает окисление глюкозы и способствует сохранению активности АТФазы в эритроцитах (табл. 3).

При анализе влияния изучаемого антиоксиданта на устойчивость эритроцитов животных, перенесших 3-кратную тотальную ишемию мозга, выявлено, что мексидол эффективно ограничивает разрушение мембран эритроцитов под влиянием агрессивного агента - реактива Фентона. Реактив Фентона является генератором гидроксильных радикалов, повреждающее действие которых обусловлено модификацией белков и, возможно, связано с воздействием на полисахариды клеточной поверхности. Кроме того, гидроксильные радикалы способны инициировать реакции ПОЛ, развивающиеся по цепному механизму. Следовательно, мексидол существенно ограничивает не только активность супероксидного радикала (выявлено на модели аутоокисления адреналина), но и активность гидроксильного радикала. Данное свойство препарата является очень ценным, т.к. нейрональные мембраны содержат большое количество ненасыщенных липидов, а невысокий уровень антиоксидантных ферментов и образование свободных радикалов при нейрохимических процессах создают дополнительные условия для окисления мембранных структур. Так, увеличение содержания АДФ и АМФ в клетке, как и повышение уровня содержания восстановленных пиридиннуклеотидов в процессе усиления анаэробного гликолиза, способствует образованию хелатированных комплексов двухвалентного железа [3,5].

Нами экспериментально установлено, что гравитационные перегрузки вызывают уменьшение уровня содержания ионов кальция в крови (до 1.90±0.03 моль/л). Введение мексидола животным опытной группы существенно препятствовало изменениям в крови содержания данного иона. Гипокальциемию, выявленную в контрольной серии опытов, можно объяснить снижением уровня содержания белка в крови, с которым связана часть кальция, а также изменением проницаемости клеточных мембран для данного иона вследствие энергодефицита, приводящего к снижению активности №⁺/К⁺-Са²⁺-АТФазы. Сопоставив изменения концентрации кальция в эритроцитах животных интактной, контрольной и опытной групп, можно предположить, что мексидол препятствует выраженным энергетическим изменениям в организме и стабилизирует мембраны, ограничивает проницаемость эритроцитов для данного катиона. Таким образом, применение мексидола препятствует нарушению энергетических процессов и ограничивает ПОЛ в эритроцитах.

Выявленное защитное действие мексидола на мембраны эритроцитов можно считать положительным прогностическим моментом, т.к. именно эти форменные элементы крови осуществляют транспорт кислорода, а также участвуют в регуляции кислотно-щелочного и агрегатного состояния крови, белковом, липидном, водно-солевом обмене [9].

Одним из основных показателей, отражающих нарушения мозгового кровообращения в ответ на ишемические (в данном случае - гипергравитационные) и реперфузионные (в период, следующий после гипергравитации) повреждения в мозге, является изменение адаптационных реакций в ответ на изменения САД [13]. Нами установлено, что у интактных животных ауторегуляторные реакции сосудов мозга поддерживаются при снижении САД до 60 мм рт. ст. У крыс, перенесших гипергравитацию, снижение САД до 100 мм рт. ст. приводило к снижению мозгового кровотока на 21.6±2.9% и увеличению сопротивления сосудов мозга на 7.8±3.6% относительно исходного уровня (табл. 4). Таким образом, у животных, не получавших лечения, уже при снижении САД до 100 мм рт. ст. происходит нарушение ауторегуляторных реакций сосудов мозга. При дальнейшем снижении САД мозговой кровоток продолжал снижаться и при 40 мм рт. ст. составлял менее 50% от исходного уровня (табл. 4). У крыс, подвергавшихся гравитационным перегрузкам в краниокаудальном положении, и у животных, предварительно получавших мексидол в дозе 5 мг/кг, ауторегуляторные реакции сосудов мозга сохранялись даже при снижении САД до 80 мм рт. ст. (табл. 4). Эффективность поддержания стабильного мозгового кровообращения благодаря исследуемому антиоксиданту при дозируемой гипотензии обусловлена сосудистым компонентом действия данного препарата. Так, у животных опытной группы наблюдалось снижение тонуса церебральных сосудов при САД 80 мм рт. ст. (на 32.4±4.8%), в то время как у животных, не получавших лечения, была зафиксирована противоположная реакция (табл. 4). Об эффективном поддержании мексидолом мозгового кровотока при снижении САД до 80 мм рт. ст. свидетельствует также коэффициент ауторегуляции (табл. 4). Таким образом, профилактически введенный мексидол ограничивает не только метаболические, но и функциональные нарушения в мозге, вызванные гипергравитацией.

Таблица 4. Динамика изменений показателей ауторегуляторных реакций мозговых сосудов крыс (M±m)

Таким образом, мексидол способствует сохранению функциональных резервов организма при гипергравитации, что свидетельствует о целесообразности применения данного препарата в качестве средства профилактики метаболических и функциональных нарушений в мозге, вызванных повторяющейся гипергравитацией. Применение мексидола в дозах 5 и 20 мг/кг способствует увеличению выживаемости животных при критических гравитационных перегрузках в краниокаудальном положении. Курсовое применение препарата в дозе 5 мг/кг способствует адаптации организма к повреждающему действию тотальной ишемии мозга, вызванной гипергравитацией, оказывает выраженное мембраностабилизирующее действие и способствует сохранению ауторегуляторных реакций мозговых сосудов.

ЛИТЕРАТУРА
1. Биохимия мозга / Под ред. И.П Ашмарина. СПб., 1999.
2. Гаевый Л.М., Анжиенко Л.М., Макарова Л.М. // Экспер. и клин. фармакол. 2000. Т. 63, № 3. С. 63-64.
3. Гусев Е.И., Скворцова В.И. Ишемия мозга. М., 2001.
4. Дюмаев К.М., Воронина Т.А., Смирнов Л.Д. Антиоксиданты в профилактике и терапии патологий ЦНС. М.,1995.
5. Камышников В.С. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике. В 2 тт. Минск, 2000.
6. Кузьминская У.П., Берсан Л.Б. // Фармакол. и токсикол. 1975. № 2. С. 102-104.
7. Лапаев Э.В., Крылов Ю.В., Кузнецов В.С. Проблемы космической биологии. М., 1983.
8. Меньшиков В.В., Делекторская Л.Н., Золотницкая Р.П. и др. Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник / Под ред. В.В.Меньшикова. М., 1987.
9. НеговскийВ.А. Очерки по реаниматологии. М., 1986.
10. Пащенко П.С. Ранняя диагностика клеточной дезадаптации у летного состава. М., 1999.
11. Поляков И.В., Соколова Н.С. Практическое пособие по медицинской статистике. Л., 1975.
12. Практикум по биохимии / Под ред. С.Е. Северина, Г.А.Соловьевой. М., 1989.
13. Саратиков А.С., Белопасов В.В., Плотников М.Б. Экспериментальная и клиническая фармакология мозгового кровообращения. Томск, 1979.
14. Справочник по лабораторным методам исследования / Под ред. Л.А.Даниловой. М., 2003.
15. Хлуновский А.Н., Старченко А.А. Концепция болезни поврежденного мозга. Методологические основы. СПб., 1999.

Комментарии