Метапрот в эксперименте

Статьи Лесиовская Е.Е.

Предыдущая глава | Содержание | Следующая глава

Метапрот в эксперименте

Энергостабилизирующие эффекты метапрота при острой гипоксии

Способность актопротекторов препятствовать при острой гипоксии нарушениям энергетического обмена была убедительно доказаны в исследованиях Бобкова Ю.Г. и соавторов (1984). Профилактическое введение метапрота (Р-148) до гипоксического эпизода в дозе 25 мг/кг сопровождалось качественно однонаправленными метаболическими изменениями в жизненно важных органах. По сравнению с не получавшими препарат животными, перенесшими острую гипоксию, на фоне действия метапрота стабилизировался углеводный энергетический резерв (рис. 2).

Рис. 2. Влияние метапрота на показатели углеводного обмена в головном мозге, сердце и печени крыс при ocтрой гипоксической гипоксии. По оси ординат - процент (%) изменения величины показателя от контроля. МК - молочная кислота (лактат), ПВК - пировиноградная кислота (пируват).

Содержание гликогена увеличивалось в тканях мозга на 27%, сердца - на 39%, печени - на 47% (р<0,05). При этом достоверно снижалось содержание глюкозы в тканях мозга на 42%, сердца - на 35%, печени - на 23%. Введение метапрота устраняло проявления лактатного ацидоза. По сравнению с не защищенными препаратом животными на фоне действия Р-148 снижалось содержание лактата в тканях мозга на 22%, сердечной мышцы - на 20%, печени - на 35% (р<0,05). Одновременно увеличивалось содержание пирувата в тканях мозга на 35%, сердца - на 45%, печени - на 25%.

Изменения содержания лактата и пирувата сопровождались достоверным снижением величины их соотношения. Все изученные показатели углеводного обмена, как и отношение лактата к пирувату, не отличались от значений в группе интактных крыс. Следует отметить, что в печени крыс, получавших бемитил, наблюдали большее снижение содержания лактата и прирост содержания гликогена, чем в других органах. Этот факт, очевидно, обусловлен утилизацией лактата на фоне действия метапрота в реакциях глюконеогенеза, протекающего преимущественно в печени.

Предварительное введение метапрота предупреждало истощение макроэргических фосфатов, наблюдаемое у не получавших препарат животных (рис. 3).

Рис. 3. Влияние метапрота на содержание креатннфосфата и адениннуклеотидов в головном мозге, сердце и печени крыс при ocтрой гипоксической гипоксии.
По оси ординат - процент (%) изменения величины показателя от контроля.
КФ - креатинфосфат;
АТФ - аденозинтрифосфорная кислота;
АДФ - аденозиндифосфорная кислота;
АМФ - аденозинмонофосфорная кислота.

Содержание креатинфосфата увеличилось в тканях мозга на 40%, сердца - на 26% (р<0.05). Содержание АТФ возросло в тканях мозга на 80%, в сердце и печени в среднем на 19% (р<0.05). Содержание АДФ достоверно снизилось на 43% в мозге, на 28% в сердце, на 25% в печени. Содержание АМФ снизилось на 38% в мозге, на 28% в сердце, на 19% в печени (р<0.05). Все значения макроэргических фосфатов и энергетический заряд адениннуклеотидного пула на фоне применения бемитила не отличались от величин от показателей в группе интактных животных.

Антиоксидантные эффекты метапрота при 30-минутной гнпокснческой гипоксии

Антиоксидантные эффекты бемитила изучали при острой гипоксической гипоксии, поднимая животных в барокамере на «высоту» 8 ООО м со скоростью 50 м/с и с экспозицией на площадке в течение 30 минут. Введение метапрота за 30 мин до гипоксического эпизода в дозе 25 мг/кг сопровождалось уменьшением накопления в головном мозге содержания диеновых конъюгатов на 22%, кетотриеновых конъюгатов на 67% и малонового диальдегида на 45% (р<0.05). В мозге крыс достоверно возрастало содержание SH-групп белков на 18% (табл. 5). Увеличение содержания восстановленного глутатиона на 23%, очевидно, было обусловлено активирующим воздействием метапрота на глутатионредуктазу. Сохранение пула тиоловых компонентов на фоне действия метапрота важно для поддержания целостности клеточных мембран, мембранных белков и активности ферментов.

ТАБЛИЦА 5

Влияние метапрота (бемитила) на процессы перекисного окисления липидов в головном мозге крыс при острой гипоксии (М ± m)
(Зарубина И.В., Миронова О.П., 2002)

ПоказателиГруппа животныхМозг
Диеновые конъюгаты, нмоль/г тканиИнтактные животные18.33 ±0.83
Гипоксия (контроль)20.75±0.66а
Бемитил+гипоксия16.25± 0.49 аб
Малоновый диальдегид, нмоль/г тканиИнтактные животные8.85 ±0.63
Гипоксия (контроль)16.69±0.24а
Бемитил+гипоксия 9.25 ± 0.64б
Супероксиддисмутаза, ЕА/мг белкаИнтактные животные2.63 ± 0.03
Гипоксия (контроль)2.20 ± 0.05а
Бемитил+гипоксия2.24 ± 0.06 аб
SH-группы, мкмоль/г тканиИнтактные животные3.47 ± 0.07
Гипоксия (контроль)2.96 ± 0.10а
Бемитил+гипоксия 3.49 ± 0.07б
Восстановленный глутатион, мкмоль/г тканиИнтактные животные31.57 ± 0.82
Гипоксия (контроль)23.10± 1.23а
Бемитил +гипоксия28.36± 1.02 аб
Глутатиоредуктаза, нмоль АДФН/мин мг белкаИнтактные животные22.97 ± 0.35
Гипоксия (контроль)19.65 ± 0.53а
Бемитил+гипоксия26.72 ± 0.88аб
Глутатионпероксидаза, нмоль НАДФН/мин мг белкаИнтактные животные6.98 ± 0.06
Гипоксия (контроль)5.84 ± 0.28аб
Бемитил+гипоксия7.98 ± 0.25аб
Глутатионтрансфераза, нмоль ХДНБ/мин мг белкаИнтактные животные61.06 ± 0.64
Гипоксия (контроль)57.50±1.12а
Бемитил+гипоксия59.81±2.97
Примечания:
а - достоверность различий (р < 0.05) по сравнению с группой интактных животных;
б - достоверность различий по сравнению с гипоксической группой.

Метапрот в мозге крыс восстанавливал активность ферментов, занимающих центральное место в антиоксидантной глутатионовой системе (Зарубина И.В, Миронова О.П., 2002 а, б, в). Так, активность глутатионпероксидазы увеличивалась на 37% по сравнению с действием гипоксии и на 14% по сравнению с уровнем у интактных животных. Активность глутатионтрансферазы при этом не отличалась от значений в группе интактных животных. Можно полагать, что сохранение активности этих синергично действующих ферментов при введении метапрота обеспечивает эффективную и многоуровневую защиту нейронов от повреждающего действия активных форм кислорода и продуктов пероксидации. Активность глутатионредуктазы, обеспечивающей ресинтез восстановленного глутатиона, увеличивалась на 36%. Активность супероксиддисмутазы возрастала слабее - на 10% (р<0.05).

Таким образом, метапрот оказывает выраженное антиоксидантное действие в головном мозге крыс при острой гипоксической гипоксии. Однократное профилактическое введение метапрота в дозе 25 мг/кг массы тела за 30 мин до воздействия гипоксии тормозит активацию процессов перекисного окисления липидов и подавление антиоксидантных систем, а также активирует глутатионпероксидазу и глутатионредуктазу в головном мозге крыс.

В печени бемитил также оказывает выраженное защитное действие на глутатионовую антиоксидантную систему (табл. 6). По сравнению с действием острой гипоксии на фоне применения метапрота в печени возрастало содержание восстановленного глутатиона на 26% и свободных SH-групп белков на 37% (р<0.05). Введение метапрота предупреждало угнетение в печени активности глутатионредуктазы и глутатионпероксидазы. В печени крыс, получавших метапрот, активность глутатионредуктазы достоверно возрастала на 12%, а глутатион-пероксидазы - на 18%, глутатионтрансферазы на 22% (р<0.05). При этом содержание глутатиона, активность глутатионредуктазы и глутатионтрансферазы не отличались от значений в печени интактных животных. Очевидно, что на фоне действия метапрота глутатион не только активно включался в пероксидазные и трансферазные реакции по обезвреживанию перекиси водорода и липидных пероксидов, но и активно восстанавливался глутатионредуктазой.

ТАБЛИЦА 6

Влияние острой гипоксии на показатели глутатионовой системы в печени крыс (М ± m)
(Зарубина И.В., Миронова О.П., 2002)

ПоказателиГруппы животныхПечень
SH-группы, мкмоль/гИнтактные животные 5.39±46
Гипоксия2.71 ±07а
Метапрот + гипоксия3.70 ±23аб
Восстановленный глутатион, мкмоль/гИнтактные животные73.15 ±2.56
Гипоксия60.06 ±0.51а
Метапрот + гипоксия75.46 ± 1.74б
Глутатионредуктаза, нмоль НАДФН/мин мг белкаИнтактные животные71.48 ± 1.45
Гипоксия63.06 ±2.35а
Метапрот + гипоксия70.40 ± 1.95б
Глутатионтрансфераза, нмоль ХДНБ/мин мг белкаИнтактные животные475.3 ± 18.4
Гипоксия404.2 ± 17.5а
Метапрот + гипоксия491.6 ± 21.1б
Глутатионпероксидаза, нмоль НАДФН/мин мг белкаИнтактные животные12.33 ±0.45
Гипоксия8.11 ±0.33а
Метапрот+ гипоксия9.54 ± 0.36аб
Примечания:
а - достоверность различий (р<0.05) по сравнению с группой интактных животных;
б - достоверность различий по сравнению с гипоксической группой.

Стабилизация глутатионовой системы при острой гипоксии под влиянием метапрота может быть обусловлена способностью препарата влиять на синтез антиоксидантных ферментов глутатионовой системы.

В дальнейшем с помощью избирательного ингибитора синтеза белка актиномицина D было подтверждено это положение о механизмах действия метапрота (Бобков Ю.Г. и соавт., 1984, рис. 4).

Рис. 4. Влияние метапрота (бемитила) на содержание общего белка и активность антиоксидантных ферментов при ocтpoй гипоксии на фоне действия актиномицина D.
По оси ординат - процент (%) изменения величины показателя.
ГПО - глутатионпероксидаза;
ГР - глутатионредуктаза.

Блокада синтеза белка актиномицином D, введенным животным в дозе 250 мкг/кг за час до гипоксии, сопровождалась снижением в печени активности антиоксидантных ферментов глутатионовой системы. Введение метапрота на фоне действия актиномицина D не оказывало защитного эффекта на активность глутатионовых ферментов. Активность глутатионпероксидазы, глутатионтрансферазы и глутатионредуктазы в печени при одновременном применении метапрота и актиномицина была ниже, чем при действии острой гипоксии и не отличалась от значений в группе животных, перенесших блокаду синтеза белка при острой гипоксии. Следовательно, актиномицин D снимал позитивный модулирующий эффект метапрота на активность антиоксидантных ферментов глутатионовой системы. Эти факты позволяют утверждать, что защитные эффекты метапрота при острой гипоксии могут быть обусловлены его способностью усиливать синтез антиоксидантных ферментов глутатионовой системы.

Предупреждение метапротом угнетения в печени крыс антиоксидантной глутатионовой системы, участвующей в формировании неспецифической резистентности организма, может ускорять адаптацию организма к острой гипоксии.

Влияние метапрота на физическую выносливость в условиях гипоксической гипоксии

В экспериментальных исследованиях, связанных с изучением физической работоспособности, наибольшее распространение получило использование плавательного теста и третбанов (Сергеев Ю.П. и соавт., 1979; Бобков Ю.Ф. и соавт. 1984; Пастушенков JI.B., 1989)

В наших исследованиях применяли плавательный тест в модификации (Лесиовская Е.Е.,1993). Крыс самцов помещали индивидуально в цилиндры для плавания глубиной 90 см и диаметров 20 см в воду, подогретую до 28,0±0,5°С. Плавание осуществляли с грузом 7% от массы тела. В течение 2 дней, предшествовавших опыту, крыс адаптировали к условиям эксперимента путем проведения «тренировочного» плавания по 5 и 10 мин с грузом 7% от массы тела. Оценивали длительность плавания до полного истощения («отказ от плавания в виде «утопления» - животное не всплывает в течение 1 минуты). Результаты представлены в таблице 7.

ТАБЛИЦА 7

Сравнение влияния метапрота и фенамина на длительность плавания крыс с грузом 7% от массы тела (в каждой группе по 10 животных, Лесиовская Е.Е., 1993)

ПрепаратДоза, мг/кгДлительность плавания, минИзменения в % к контролю
Контроль (физ. раствор)1 мл/кг15,7±1,8-
Фенамин1023,7±1,7+51
Метапрот5024,2±1,5+54
Метапрот10033,4±5,8+112

Метапрот проявил выраженный актопротекторный эффект. Длительность плавания животных с грузом увеличивалась в 1,5-2 раза.

Изучение метапрота под рабочим шифром Р-148 в условиях бега на третбане было проведено Ю.Г.Бобковым с соавторами (1984). Для исследования в условиях бега на третбане они использовали максимальную скорость движения ленты, подобранную таким образом, чтобы у животных наблюдалась максимальная скорость потребления кислорода на третбане с наклоном ленты 10°. Для крыс линии Вистар она составила 41-45 м/мин. При этом средняя длительность бега контрольных крыс не превышала 30 мин. Животных предварительно отбирали с исключением агрессивных животных и предварительно тренировали их на протяжении 2-3 дней (по 5-10 минут на небольшой скорости). Критерием наступления утомления являлся момент, когда животное отказывалось продолжать бег, несмотря на электрические разряды. Результаты представлены в таблице 8 и 9.

ТАБЛИЦА 8

Результаты сравнения влияния метапрота и фенамина на длительность бега крыс в третбане при нормальном давлении (в каждой группе 8-10 крыс)
(Бобков Ю.Г. и соавт., 1984)

ПрепаратДоза, мг/кгДлительность бега, минИзменения в % к контролю
Контроль (физ. р-р)1 мл/кг21,2±1,6-
Фенамина сульфат6,072,4±1,6+230
Контроль (физ. р-р)1 мл/кг18,2 ±2,4-
Р-1482542,4±1,2+132
Р-1485036,7±1,8+101

ТАБЛИЦА 9

Результаты сравнения влияния метапрота и фенамина на длительность бега крыс в третбане на «высоте» 4 и 6 км (в каждой группе 8-10 крыс)
(Бобков Ю.Г. и соавт., 1984)

ПрепаратДоза, мг/кгДлительность бега, минИзменения в % к контролю
Контроль (физ.р-р), 4 км1 мл/кг14,8±1,0-
Фенамина сульфат, 4 км6,018,6±1,7+26
Контроль (физ.р-р) 4 км1 мл/кг17,02±1,0-
Р-148, 4 км5028,4±1,9+67
Контроль (физ.р-р), 6 км1 мл/кг7,5±0,6-
Фенамина сульфат, 6 км6,08,3±0,7+10
Контроль (физ.р-р), 6 км1 мл/кг8,8±1,0-
Р-148, 6 км5017,6±1,8+100

Метапрот в условиях бега на третбане во всех сериях опытов превосходил по активности фенамин. Он обеспечивал увеличение длительности бега крыс до утомления в 2,4 раза эффективнее, чем фенамин, на «высоте» 4 км и в 10 раз - на «высоте» 6 км.

Аналогичные результаты были получены в наших исследованиях при циклических нагрузках (бег циклами по 10 мин с десятиминутными перерывами, каждый следующий цикл шел на фоне накапливающегося утомления) в тесте бега на третбане. В этих жестких условиях циклических нагрузок фенамин снижал выносливость крыс на 14-16%. Метапрот оказывал достаточно выраженный актопротекторный эффект - прирост времени бега составил 34-42% (Лесиовская Е.Е., 1993).

Таким образом, в условиях моделирования истощающих физических нагрузок метапрот проявил высокую актопротекторную активность, он существенно превышал эффект психостимулятора фенамина в условиях гипоксии. Причиной этого являлось экономизирующее влияние метапрота на энергетический обмен в отличие от истощающего влияния на него фенамина.

Энергостабилизирующие эффекты метапрота при выполнении стандартных нагрузок

В экспериментах крысы выполняли динамическую нагрузку на третбане при скорости движения ленты 42 с/мин (Бобков Ю.Г. и соавтр., 1984.-С.70-81). Мощность нагрузки была рассчитана на основе анализа длительности работы большей выборки контрольных животных. В нормальных условиях объем выполняемой работы составил 216 кГм, в условиях барокамеры скорость движения ленты была снижена до 35 м/мин и объем составлял 98 и 54 кГм на «высотах» 4 и 6 км, соответственно (во всех сериях опытов данный объем работы составил 70-80% от предельного и рассматривался как стандартный. В части опытов анализировали биохимические сдвиги в крови и органах крыс при гемической гипоксии на фоне предварительного введения нитрита натрия в дозе 20 мг/кг подкожно.

При анализе биохимических сдвигов исследовали содержание в крови лактата, пирувата, глюкозы, неорганического фосфора по общепринятым методикам после добавления к крови 6% раствора НС104, в замороженных тканях печени, миокарда, мышцы изучали содержание креатина и креатинфосфата, гликогена. Энзиматическими методами определяли содержание глюкозо-6-фосфата (Г-6-Ф), дигидроксиацетонофосфата (ДГАФ), α-кетоглутарата, фосфоенолпирувата (ФЕП), малата, АМФ, лактата и пирувата. Для крови вычисляли отношение глюкоза-лактат, избыточный лактат по формуле W.Huckabee (1958) и отношение НАД/НАД Н2 из величин лактата и пирувата в крови и тканях рассчитывали константу для ЛДГ-реакции принимали равной 1,11 хЮ-4 (Прохорова М.И., 1982), в котором сождержание Фн принимали равным 60% от определяемого (Скулачев В.П., 1972) и энергетического заряда (ЭЗ) - (АТФ+0,5 АДФ)/ (сумма адениннуклеотидов Σ АН) (Atkinson D, 1968). Метапрот вводили за 1 час до выполнения нагрузки. Результаты представлены в таблице 10.

ТАБЛИЦА 10

Содержание метаболитов (мкмоль/л) энергетического обмена в мышцах крыс (n=8-10) после завершения стандартной работы на фоне метапрота (Р-148, 50 мг/кг через рот)
(Бобков Ю.Г. и соавт.,1984)

Биохимические показателиПокойКонтрольМетапрот
Гликоген (мг/кг) 5,18±0,241,43±0,421) 2,11±0,171),2)
Глюкоза4,38±1,24,84±0,875,07±0,68
Г-6-Ф0,43±0,050,11±0,041)0,17±0,041),2)
ДГАФ0,04±0,010,06±0,031)0,11±0,021),2)
ФЕП0,06±0,020,02±0,0041)0,21±0,011),2)
Пируват (П)0,15±0,040,21±0,021)0,22±0,041)
Лактат (Л)5,15±0,547,18±0,861)5,72±0,462)
Л/П34,333,724,4
НАД/НАДН2 по ЛДГ450305420
α-кетоглутарат0,028±0,0070,071±0,0041)0,058±0,0021),2)
Малат0,25±0,010,65±0,041)0,41±0,051),2)
Креатинфосфат10,71±1,201,85±0,641)4,98±0,951),2)
Креатин12,13±1,4516,00±2,501)11,34±1,782)
АТФ4,44±0,762,55±1,421)2,98±0,561)
АДФ0,49±0,040,68±0,051)0,68±0,041)
АМФ0,08±0,010,18±0,041)0,12±0,021)
Фн4,33±0,116,38±0,751)6,08±0,561)
ФП2,150,971,21
ЭЗ0,9070,8460,878
Примечания:
1) отличия между опытом или контролем и интактными животными существенны: р<0,005;
2) отличия между опытом и контролем существенны: р< 0,005;

Анализ метаболитов энергетического обмена в мышце на фоне метапрота после завершения стандартной нагрузки (табл.10) позволил показать большую сохранность фонда гликогена и большую восстановленность пиридиннуклеотидов, что сочетается с большей сохранностью фонда КФ и АТФ, а также существенной большей величины ФП и ЭЗ. Суммируя полученные результаты, авторы приходят к выводу, что на фоне метапрота лучшая сохранность биохимического гомеостаза обеспечиватся:
1. большей утилизацией образующегося лактата в процессе самой работы.
2. активацией окислительных реакций в мышцах и миокарде, позволяющих регенерировать фонд АТФ за счет более выгодных реакций оксилительного фосфорилирования.
3. стимуляцией гликонеогенеза до начала и во время работы, который в принципе имеет место по ходу аэробной работы в печени и почках.

В отдельной серии опытов на мышах авторы получили доказательства способности актопротектора использовать экзогенный лактат с целью увеличения фонда гликогена в органах и об образовании дополнительного фонда гликогена на фоне его введения к моменту начала работы.

В первой серии опытов молочную кислоту (40% раствор) вводили мышам в дозе 40,80 и 100 мг/кг, что приводило к увеличению гликогена в печени и миокарде. На фоне предварительного введения Р-148 (метапрота) минимальная из используемых доз лактата приводила к существенно большему содержанию гликогена в органах, что позволяет считать процесс перевода лактата в гликоген более полным.

Во второй серии опытов физические нагрузки имитировали введением фенилэфрина (адреналина, 0,5 мг/кг подкожно), который, как и в случае его выброса при физической работе, активирует гликолиз и гликогенолиз, увеличивая содержание глюкозы в крови и снижая содержание гликогена в органах. На фоне предварительного введения метапрота (за 1 час до введения адреналина) увеличение содержания глюкозы в ответ на адреналин не ниже, чем у контрольных животных, но содержание гликогена в печени и миокарде через 30 мин после введения адреналина было существенно выше, чем у контрольных животных.

Анализ полученных в этих экспериментах результатов свидетельствует о лучшем протекании метаболических реакций на фоне применения метапрота. При его введении работа совершается на фоне меньшего анаэробиоза, что способствует увеличению ее длительности. И метаболические сдвиги, вызванные предварительным введением метапрота, направлены на подстройку метаболизма в клетке в сторону увеличения энергетического потенциала, который в конечном счете и определяет жизнеспособность клетки при различных экстремальных воздействиях (Меерсон Ф.З., 1981).

Исследование влияния метапрота (Р-148) на энергетический обмен в период восстановления после интенсивных физических нагрузок также было проведено в условиях бега на третбане (Бобков Ю.Г. и соавт., 1984.-С. 107-129). Метапрот вводили сразу после нагрузки до отказа. Затем отдельные группы крыс совершали повторную работу до полного утомления после различных интервалов отдыха. Эффект препарата имел фазный характер. Ранняя фаза - фаза быстрого восстановления работоспособности - включает первые 2 часа после нагрузки. При этом работоспособность увеличивается от 0 до57% исходной величины. Промежуточная фаза - фаза стабилизации работоспособности на уровне 53-57% охватывает интервал от 2 до 8 часов. Она переходит в позднюю фазу - фазу постепенного восстановления до исходного уровня, достигаемого после 48 часов отдыха.

Метапрот ускорял процесс восстановления работоспособности в ранней и поздней фазах периода восстановления. В промежуточной фазе он не влиял на работоспособность. В ранней фазе после часа отдыха прирост длительности бега контрольных животных составил 41%, на фоне метапрота он составил 77%. В поздней фазе периода восстановления эффект метапрота был еще более выражен - через 24 и 48 часов длительность бега увеличивалась на 190% и 200%. В период стабилизации работоспособности и даже в серии с введением препарата повторно в этой фазе не было получено увеличения длительности бега, однако, отмечено существенное увеличение содержания гликогена и РНК в органах. Именно в промежуточной фазе (после 4 часов отдыха) происходило увеличение РНК в мышцах и сердце, в которых в поздней фазе препарат не влиял на данный показатель. В то же время метапрот увеличивал содержание РНК во всех изученных органах в ранней фазе периода восстановления (через 1 час после ИФН). Подобное действие препарата отражает его активирующее влияние на протеинсинтез непосредственно при нагрузке.

Таким образом, высокая восстанавливающая активность метапрота позволяет вполне согласиться с Ю.Г.Бобковым и предполагать «перспективность его применения как для восстановления физической работоспособности, так и в более широком плане - для ускорения различных реабилитационных процессов после заболеваний, травм и экстремальных воздействий».

Фервопротекторный эффект метапрота

Проблема повышения устойчивости организма человека к высоким температурам окружающей среды далека от своего разрешения. Поиск препаратов, которые повышают переносимость высоких температур, ведется в различных направлениях (Смирнов А.В., 1989; Яременко К.В., 1990; Новиков С.В. и соавторы, 1998). У многих антигипоксантов выявлен фервопротекторный эффект (Лосев А.С. и соавт., 1989; Лесиовская Е.Е., 1993). Поскольку чрезвычайно важным в социальном плане является сохранение и поддержание работоспособности в условиях перегревания, метапрот исследовали в этом направлении в экспериментах.

Применение антигипоксантов у животных, не адаптированных к перегреванию давало недостаточный по выраженности защитный эффект (Новиков B.C. и соавторы, 1998). Поэтому в серии работ было изучено влияние метапрота на процесс адаптации животных к перегреванию. В условиях моделирования дробной тепловой адаптации были получены данные об эффективности метапрота. В экспериментах был доказан фервопротекторный эффект метапрота в условиях повышения температуры внешней среды. Наиболее эффективным вариантом адаптации оказалось импульсно-прерывистое тепловое воздействие с введением метапрота непосредственно после завершения каждого из сеансов перегревания. Белых крыс (масса тела 180-220 г) помещали в термостат при температуре 40°С и относительной влажности 35-37%. Сеанс состоял из трехкратного 20-минутного теплового воздействия с интервалом 40 мин. Оптимальная длительность курса составила три дня. Метапрот (бемитил) вводили внутри-брюшинно в дозе 50 мг/кг непосредственно после окончания каждого сеанса тренировки в термокамере. Тепловую устойчивость животных оценивали по двум показателям:
- выживаемости в условиях непрерывного воздействия температуры воздуха +40°С;
- предельной длительности плавания в при температуре воды +40°С и грузом 5% от массы тела животного.

Результаты представлены в таблице 11.

ТАБЛИЦА 11

Результаты влияния метапрота (бемитила) на адаптацию животных к гипертермии (цит. По Новиков B.C. и соавт, 1998,с.199)

ПоказательИнтактные животныеТермоадаптированные животные (ТЖ)ТЖ + МетапротВлияние метапрота на термоадаптацию, %
Среднее время жизни при температуре +40°С, мин78±1 (100%)91±4 (116%)102±4 (131%)+15**
Выживаемость на 75-й мин.,%3250*81+31**
Выживаемость на 95-й мин, %838*55 +17**
Среднее время плавания грузом 5% в воде при температуре +40°С9±1 (100%)13±1 (148%)*24±4 (267%)+119**
Доля животных, сохранивших работоспособность через 9 мин, %3564*78+14
Доля животных, сохранивших работоспособность через 12 мин, %274173+32**
Доля животных, сохранивших работоспособность через 15 мин,%172373+50**
Доля животных, сохранивших работоспособность через 18 мин, %51847+29**
Примечания:
1. Отличие от уровня интактных (*-р< 0,05) и адаптированных (**-р<0,05) животных.
2. Среднее время жизни животных в условиях перегревания и среднее время плавания при трехдневном введении метапрота без термоадаптации 83±4 мин (103% от контроля) и 9±2 мин (102% от контроля).

Метапрот существенно повышал степень адаптации животных к перегреванию. Его применение увеличивало среднее время жизни животных на 15 %. Влияние препарата на физическую выносливость при перегревании было выражено еще больше (более чем в 2,5 раза по сравнению с неадаптированными крысами).

Была доказана высокая термопротективная активность метапрота как по влиянию на длительность жизни в условиях высокой температуры (40°С) и на продолжительность плавания с грузом в условиях перегревания у животных, которых подвергали трехдневной импульсной адаптации к перегреванию (табл.12, 13).

ТАБЛИЦА 12

Фервопротекторная активность метапрота при внутри-брюшинном введении мышам в условиях перегревания (при температуре внешней среды +40°С, по Муравьеву А.В., 1998 с сокращениями)

ПрепаратДоза, мг/кгПродолжительность жизни, минПродолжительность плавания в воде при температуре 40°С с грузом 5% от массы тела, мин
Плацебо-71,2±3,56,3±0,3
Экстракт элеутерококка471,9±6,46,3±0,5
Олифен (гипоксен)10075,4±2,86,6±0,2
Метапрот (бемитил)50102,3±9,9*8,8±0,7*

ТАБЛИЦА 13

Влияние термоадаптации и метапрота (бемитила, 50 мг/кг) на биохимические показатели сыворотки крови белых крыс в терминальной фазе перегревания в термокамере при температуре +40°С (Муравьев А.В., 1998)

Показатель, единицы измерения Без термоадаптации Термоадаптация Термоадаптация +Метапрот
КонтрольМетапрот
Альбумины, г/л33,0±1,034,0±1,031,5±2,536,0±2,5
Глобулины, г/л27,8±1,925,0±1,720,8±2,0*20,5±2,0*
Общий белок, г/л60,0±1,060,0±1,051,0±1,0*56,0±1,0*
Креатинин, моль/л149±27122±11108±795±7
ЛДГ, моль/л625±261013±106469±12*499±11*
АЛАТ, моль/л45±156±6133±5*78±5*#
АСАТ, моль/л222±12243±7172±11*87±10*#
Общий билирубин, моль/л19,6±4,414,7±2,5 8,1±0,8*5,6±0,8*#
Триглицериды, моль/л3,1±0,24,2 ±0,43,6±0,22,2±0,2*
Глюкоза, моль/л6,5±0,46,4±0,57,2±0,37,0±0,3
МДА, мкмоль/ мл1,81±0,171,47±0,1З1,23±0,15*1,10±0,14*
Гидроперекиси липидов, мкмоль/мл244±24190±23176±21*158±20*
Примечания:
* -различия по сравнению с контролем существенны: р<0,05;
# -различия по сравнению с термоадаптацией существенны: р<0,05.

У животных, получавших метапрот до начала адаптации к перегреванию, выявлена тенденция к увеличению активности ЛДГ и АСАТ. Изменения активности ферментов в группе термоадаптированных животных свидетельствуют о неустойчивой адаптации, т.к. наряду со снижением активности АСАТ -свидетельства стабилизации мембран гепатоцитов, наблюдалось повышение уровня АЛАТ - сдвиг противоположной направленности. Под влиянием метапрота адаптация стала более стабильной. В условиях перегревания метапрот устранял вызванное перегреванием увеличение уровня АЛАТ, АСАТ и общего билирубина. Снижение уровня триглицеридов в термоадаптированной группе на фоне метапрота является благоприятным сдвигом, поскольку может способствовать снижению ПОЛ и разобщение окисления и фосфорилирования.

Таким образом, в экспериментальных условиях была убедительно доказана фервопротекторная активность метапрота, которая в полной мере реализовалась в условиях дробной термоадптации животных.

Фригопротекторный эффект метапрота

Угроза переохлаждения возникает часто в неблагоприятных климато-географических условиях, а также при стихийных бедствиях и катастрофах. Выполнение работ в зимний период, особенно в условиях крайнего Севера, промышленное освоение залежей полезных ископаемых под водой и связанные с этим глубоководные погружения, полеты в космос и наземная транспортировка грузов зимой предъявляют повышенные требования к адаптационных резервам организма человека. Поэтому поиск средств, повышающих устойчивость к холоду - фригопротекторов ведется давно (Куманичкин С.Д., 1954; Коваленко В.П., Пастухов В.В., 1982; Пастушенков JIB, 1989; Кулинский В.И., Плотников А.Ю., 1986). Борьбу с гипотермией ведут по двум основным направлениям:
1. Регуляция интенсивности экзотермических процессов для стабилизации теплового равновесия организма с окружающей средой низкой температуры.
2. Повышение устойчивости тканей к повреждающему действию холода.

Повышение выработки метаболического тепла в клетках в условиях гипотермии может быть достигнуто несколькими путями:
- увеличением субстратного и ферментного обеспечения теплопродукции;
- утилизацией наиболее адекватных источников энергии и низкомолекулярных субстратов окисления;
- сдвигом соотношения между окислением и фосфорилированием в пользу свободного окисления;
- более выгодной с точки зрения увеличения теплопродукции утилизацией АТФ в жизненно важных органах (Барер А С. и соавт., 1988; Гольцев Ю.А., Макаров С.Е., 1993).

В рамках второго подхода наиболее перспективными признаются препараты экономизирующего типа действия, которые препятствуют неадекватному расходованию энергетических запасов (Бобков Ю.Г. и соавт., 1986; Смирнов А.В., 1998). К достоинствам этих препаратов следует отнести благоприятное влияние на стресслимитирующие системы и работоспособность в условиях нарушения теплового баланса (Пастушенков Л.B., 1980; Пастушенков Л.B., Лесиовская Е.Е., 1994).

Однако экспериментальные исследования показали, что метапрот в условиях низкой температуры окружающей среды проявляет недостаточную фригопротекторную активность (Гольцев Ю. А., Макаров С.Е., 1993), что подтвердилось и в последующих наблюдениях на людях (Новиков B.C. и соавт., 1998). Однако он усиливал защитные свойства пирацетама и сиднокарба в условиях переохлаждения (Новиков B.C. и соавт, 1998).

Актопротекторные свойства метапрота в условиях отравлений (Материалы из Отчета о доклинических исследованиях бемитила (метапрота), проведенных в Военно-медицинской академии им. С.М.Кирова Минобороны РФ, СПб, 2007)

Острое отравление карбофосом сопровождается выраженным нарушением физической работоспособности лабораторных животных. Время предельной продолжительности плавания (ВППП) через 1 сутки после отравления у крыс контрольной группы составило лишь 12,3 ± 1,33% от уровня данного показателя интактных животных (табл.14). В первые сутки после отравления метапрот еще не оказывал существенного влияния на показатели плавательного теста.. На 3 сутки после отравления на фоне метапрота появилась тенденция к увеличению ВППП по сравнению с показателем контрольной (р > 0,05). К 5 суткам на фоне применения метапрота ВППП на 16,3% превышало уровень контроля.

ТАБЛИЦА 14

Влияние метапрота на восстановление физической работоспособности (по данным плавательного теста, ВППП в % от уровня интактных животных) при отравлении карбофосом в дозе ЛД50 (М ± n)

Время после введения карбофоса (в сутках)Контроль (плацебо) (n = 30)Бемитил (n = 30)
112,30 ± 1,3314,20 ± 1,40
332,00 ±2,2238,50 ± 1,69*
549,50 ±2,5065,80 ± 1,58*
763,00 ± 1,4191,70 ± 1,89*
1077,70 ±2,14102,00 ± 1,94*
Примечание: * - отличия от контроля существенны: р<0,05

На 7 сутки в группе крыс отмечалось значительное восстановление физической выносливости - ВППП превысил показатель в контроле на 18,7%, а к 10 суткам после отравления работоспособность животных, получавших метапрот, была несколько выше уровня интактных крыс - 102,0 ± 1,94%, (р > 0,05), у контрольных животных восстановления физической выносливости в этот срок не наступило.

Острое отравление дихлорэтаном сопровождалось выраженным нарушением физической выносливости лабораторных животных. Результаты данного эксперимента представлены в табл. 15. Через сутки после отравления в контрольной группе снижение ВППП составило 90,3%, а на 3 сутки - 88,7%. Метапрот в первые трое суток не оказывал эффекта - ВППП в опытных группах, получавших актопротектор, не отличалось от контроля (р > 0,05). Однако уже к 5 суткам в группе животных, получавших метапрот появилась тенденция к восстановлению работоспособности (р > 0,05). К 10 суткам на фоне курсового применения актопротектора отмечено полное восстановление физической работоспособности крыс: ВППП не отличалось от уровня интактных животных, а в контроле этот показатель был на 30% ниже.

ТАБЛИЦА 15

Влияние метапрота на восстановление физической работоспособности в условиях плавательного теста при отравлении дихлорэтаном в дозе ЛД50 (ВППП в % от уровня интактных животных, М ± n)

Время после введения дихлорэтана (в сутках)Контроль (плацебо) (n = 30)Метапрот (n = 30)
19,67 ± 1,339,83 ± 1,40
321,30 ±2,0323,50 ± 1,48
533,70 ±2,1637,50 ± 1,31*
758,80 ±2,2778,80 ±2,75*
1070,20 ±2,2499,80 ± 1,38*
Примечание: * - отличия от контроля существенны: р<0,05

Таким образом, актопротектор метапрот обладает способностью ускорять восстановление физической работоспособности после тяжелого отравления диэлорэтаном. Эффект препаратов отчетливо проявляется на 5 сутки лечения и достигает максимума на 10 сутки.

Отравление этиленгликолем в дозе 1,0 ЛД50 приводит к выраженному снижению физической выносливости крыс: ВППП на 1 сутки после отравления в контрольной группе снизилось на 90,9%. На фоне метапрота тенденция к восстановлению физической выносливости отмечена на 3-и сутки. Полное восстановление физической работоспособности крыс в опытных группах отмечено к 10 суткам после отравления, тогда как в контрольной группе к этому моменту ВППП оставалось сниженным на 43,8%.

ТАБЛИЦА 16

Влияние метапрота на восстановление физической работоспособности в условиях плавательного теста при отравлении этиленголиколем в дозе ЛД50 (ВППП в % от уровня интактных животных, М. ± m)

Время после введения этиленгликоля (в сутках)Контроль (плацебо) (n = 30)Бемитил (n = 30)
19,17 ± 0,7913,00 ± 0,97*
323,70 ± 1,0925,00 ± 1,10*
537,50 ± 1,9350,30 ± 3,48**
755,20 ±2,2388,70 ± 2,78**
1066,20 ±2,12100,80 ± 1,62**
Примечание: * - отличия от контроля существенны: р<0,05

Таким образом, метапрот способствовал более быстрому восстановлению физической работоспособности крыс после тяжелого отравления этиленгликолем. Терапевтическая эффективность актопротектора проявлялась, начиная с 3 суток после отравления, и была максимальной к 10 дню после отравления.

Изучение биохимических показателей сыворотки крови животных, отравленных карбофосом в дозе 1, ЛД50, позволило установить, что интоксикация сопровождается повышением активности аминотрансфераз, концентрации билирубина, нарастанием уровня азотистых шлаков (азота мочевины). Результаты данного эксперимента представлены на рис. 5. Аналогичные изменения были получены при отравлении дихлорэтаном и этиленгликолем.

Рис.5. Влияние метапрота на вызванные карбофосом (ЛД50) нарушения некоторых биохимических показателей у крыс на 7 день после отравления
* - отличия от контроля (карбофос) статистически существенны (р<0,05) (АЛТ - аланинаминотрансфераза, АСТ-аспартатаминотрансфераза, Бил- общий билирубин, Азот моч — азот мочевины в процентах от уровня интактных животных)

Таким образом, тяжелые отравления карбофосом, дихлорэтаном и этиленгликолем сопровождались интоксикацией и нарушениями мтаболизма, которые свидетельствуют о нарушении функции печени (аминотрансферазы, билирубин) и почек (азот мочевины). Применение метапрота способствовало ускорению восстановлению физической выносливости и нормализации биохимических показателей. Терапевтический эффект актопротектора развивается на 3-7 сутки применения.

Антимутагенные свойства метапрота

С.Б. Середенин и А.Д. Дурнев (1990) показали, что метапрот (бемитил), используемый в диапазоне концентраций 0,07-0,7 мМ, достоверно (на 60-69%) подавлял эффект фотрина. Кроме того, он в концентрации 0,007 мМ снижал цитогенетическую активность диоксидина, а в концентрации 0,07 мМ - полностью устранял повреждающее воздействие мутагена. Был также установлен в условиях in vivo протекторный эффект метапрота на уровень хромосомных аберраций, индуцируемых корпускулярными мутагенами прооксидантного типа - хризолит-асбестом и цеолитом.

Известно, что свободно-радикальные процессы играют значительную роль не только в механизмах химического мутагенеза, но и в реализации генетических повреждений, вызванных ионизирующим излучением. Хромосомные аберрации, возникающие под влиянием радиации воспроизводятся в последующих генерациях клеток. Подобные явления в соматических клетках могут приводить к их опухолевому перерождению, в половых клетках - к развитию врожденных аномалий.

В дальнейшем было изучено влияния метапрота (бемитила) на мутагенный эффект проникающей радиации. В опытах на белых крысах самцах массой тела 150-180 г моделировали лучевое воздействие и вводили метапрот в дозе 18 мг/кг

- ЕД50, подобранной в исследованиях Серединина и соавторов (ШабановП. Д. и соавт., 2007). Испытывали две схемы применения: однократное введение актопротектора - непосредственно перед облучением и курсом - профилактически 5 дней до облучения; последнее введение совпадало с днем облучения. Облучение животных проводили на установке «Игур» при мощности дозы 0,0083 Гр/мин в течение 6 часов. Крыс умерщвляли через 24 часа после воздействия. Препараты хромосом костного мозга готовили по стандартной методике. Анализировали по 500 метафаз на каждый вариант опыта, что соответствует общепринятым требованиям. Учитывали количество аберрантных хромосом и количество поврежденных клеток.

ТАБЛИЦА 17

Влияние метапрота на мутогенное действие ионизирующего облучения в дозе 3 Гр, полученных в течение 6 часов (М ± m)

Препарат, доза, мг/кгСпособ введенияСхема введенияОблучение, 3 Гр/6 ч% повреждения клеток% хромосомных аберрацийр в сравнении с контролем
без препарата--+10 ± 0,711 ±0,7-
М, 18внутри-брюшиннооднократно-1 ±0,41 ±0,4<0,05
М, 18внутри-брюшиннооднократно+5 ± 0,986 ± 0,98<0,05
М,180внутри-брюшиннооднократно-2 ±0,62 ±0,6<0,05
М,180внутри-брюшиннооднократно+3 ± 0,73 ± 0,7<0,05
Метапрот (М)18per os5 дней-0 ± 0,20 ± 0,2<0,05
М, 18per os5 дней+7 ±129± 13>0,05

Принимая во внимание дискуссионность вопроса о выборе стандартного мутагена для тестирования средств фармакологической защиты генома, были максимально объективизированы данные о мутагенном действии ионизирующего излучения в дозе 3 Гр, полученной в пролонгированном режиме. Для этого объем выборки в группе «контроль облучения» был увеличен в 4 раза (по сравнению со стандартным протоколом) путем привлечения результатов аналогичных экспериментов, поставленных в стандартных условиях примерно в тоже время.

В результате эксперимента установлено, что облучение в дозе 3 Гр (6 час) вызывает появление 11,0 ± 0,7% хромосомных мутаций в клетках костного мозга крыс и повреждает 10,7% клеток этой ткани. Это значительно выше спонтанного мутационного фона, составляющего в среднем 1% аберрацию. Показано, что метапрот при однократном внутри-брюшинном введении уменьшает количество мутаций хромосом: при дозе препарата 18 мг/кг - в 2 раза, при дозе 180 мг/кг - больше, чем в три. Более того, в последнем случае мутационный фон статистически не отличается от спонтанного. Установлено также, что применение препарата в изученных дозировках вне облучения является генетически безопасным.

Таким образом, установлено, что однократное применение бемитила (внутри-брюшинно в дозах 18 и 180 мг/кг) перед облучением защищает геном от повреждающего действия ионизирующего излучения в дозе 3 Гр (6 час). Данное исследование в совокупности со сведениями, известными из литературных источников, определяет перспективу практического использования препарата в качестве средства защиты генетических структур от повреждающего действия экзогенных прооксидантных агентов.

Предыдущая глава | Содержание | Следующая глава

1 февраля 2011 г.

МЕДИ РУ в: МЕДИ РУ на YouTube МЕДИ РУ в Twitter МЕДИ РУ на FaceBook МЕДИ РУ вКонтакте Рейтинг@Mail.ru Яндекс.Метрика