Хемилюминесцентный метод определения грибковой сенсибилизации у детей с аллергическими заболеваниями легких

Опубликовано в журнале:
Практика педиатра, ноябрь-декабрь, 2017

А. В. Семенов, к.м.н., ОСП НИКИ педиатрии им. акад. Ю.Е. Вельтищева ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова, г. Москва, Т. А. Миненкова, к.м.н., кафедра педиатрии Государственного медицинского университета г. Курск, Е. И. Шабельникова, к.м.н., ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова, г. Москва, Ю. Л. Мизерницкий, д.м.н., профессор, ОСП НИКИ педиатрии им. акад. Ю. Е. Вельтищева ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова, г. Москва

Ключевые слова: заболевания бронхолегочной системы, грибковая сенсибилизация, фагоциты, хемилюминесценция, диагностика, дети
Keywords: lung diseases, fungi sensibilization, phagocytes, chemiluminescence, diagnostic, children
Проблема аллергических заболеваний органов дыхания, ассоциированных с гиперчувствительностью к грибковым аллергенам, в связи с нарастающей их распространенностью, нередкой ассоциацией с тяжелым течением, недостаточной эффективностью терапии, является весьма актуальной для педиатрии.

Трудности диагностики и дифференциальной диагностики бронхолегочной патологии у детей с сенсибилизацией к грибковым аллергенам обусловлены многообразием видов патогенных грибов и клинических проявлений заболевания. Ранее внимание клиницистов обращалось, в основном, на болезни, связанные с сенсибилизацией к грибам рода Aspergillius, в то время как целый ряд других, широко распространенных патогенных грибов выпадал из поля зрения [1].

Аллергия к грибковым антигенам может проявляться различными клиническими формами, что затрудняет их диагностику и целенаправленное лечение.

Установлено, что антигены грибов родов Aspergillius, Alternaria, Candida, Rizopus, Penicillium чрезвычайно широко распространены внутри жилых и общественных помещений, обладают высокой аллергенностью, вызывают иммунные реакции I, а также III типов. В свою очередь механизмы патогенеза этих заболеваний и их прогноз до конца не ясны [1]. Известно, что в развитии аллергии большое значение имеют клетки Т-хелперы 2 типа, продуцирующие интерлейкины – 4, 5, 6, 13, стимулирующие синтез IgE, IgA, IgG1, ингибирующие продукцию IgM, IgG3, IgG2, усиливающие либерацию гистамина тучными клетками и активацию в них MAP-киназ, повышающих жизнеспособность и цитотоксичность эозинофилов, фагоцитов (увеличивая потенциал респираторного взрыва), индуцирующих острофазный ответ и иммуногенез, подавляющих продукцию провоспалительных цитокинов [2, 3, 4] .

Впервые идею о том, что живые клетки человека и животных могут излучать слабый свет в ультрафиолетовой области спектра, сформулировал русский ученый Александр Гаврилович Гурвич. Это излучение было названо им митогенетическим [5]. Свечение при этом связано с образованием и превращением свободных радикалов [6, 7, 8].

Позже, в 1954 году доктор Денхам Харман, профессор университета Небраски, высказал предположение о связи причины развития старения и некоторых заболеваний с повреждающим действием свободных радикалов на организм человека [9]. Спустя сорок лет эта теория стала ведущей, объясняющей причины возникновения и развития более шестидесяти различных заболеваний. Среди них такие страшные недуги, как рак, атеросклероз, стресс, бронхиальная астма, артроз, варикозное расширение вен, болезни печени, почек, гипертензия, нарушение памяти, сахарный диабет и другие. Хемилюминесцентный метод исследования дает возможность изучить как теоретические аспекты данных заболеваний, так имеет и практическое значение (для контроля эффективности терапии и т. д.) [1, 3, 10, 11, 12, 13]. Свободно-радикальное окисление является одним из универсальных механизмов повреждения клеток, но, вместе с тем, как установили сравнительно недавно, этот процесс необходим для нормального функционирования клеток [2, 8].

Важную роль в иммунном ответе на грибы, их элиминации играют фагоцитарные реакции организма. Одним из основных свойств фагоцитов является их способность отвечать на соответствующий стимул генерацией активных форм кислорода (перекиси водорода, супероксидного аниона, гидроксильного радикала), играющих важную роль в реализации микробицидной функции гранулоцитов. В середине 70-х годов прошлого века была предложена методика оценки киллинговой способности фагоцитов методом хемилюминесценции. Проблема, однако, заключалась в очень низкой интенсивности квантового свечения и сложности его регистрации [2].

В настоящее время появились хемилюминометры с программным обеспечением, позволяющие регистрировать достаточно слабые сигналы света, а также люминофоры, способствующие усилению светового сигнала. Таким образом, возникла реальная возможность количественной оценки переваривающей способности фагоцитов путем регистрации хемилюминесцентной активности клеток: интенсивности свечения, динамики его нарастания в ходе респираторного взрыва, оценки времени выхода на плато, отражающего установившееся равновесие между утилизацией кислорода и выделением активных форм кислорода в межклеточную среду. Появилась возможность оценивать чувствительность фагоцитов к различным агентам и осуществлять комплекс превентивных мероприятий.

В связи со сказанным выше целью настоящей работы стало изучение возможности использования метода хемилюминесценции нейтрофилов для диагностики чувствительности к грибам у больных с аллергическими заболеваниями легких.

Клиническая характеристика больных и методы исследования

Обследовано 60 детей с различными хроническими заболеваниями бронхолегочной системы наблюдавшихся в отделении пульмонологии Научно-исследовательского клинического института педиатрии имени академика Ю. Е. Вельтищева ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России. В исследование включали пациентов с подтверждённой лабораторными методами сенсибилизацией к грибковым аллергенам и анамнестическими указаниями на постоянный контакт с ними. Исследование одобрено Этическим комитетом.

Диагноз и тяжесть бронхиальной астмы устанавливали в соответствии с критериями, изложенными в научно-практической программе «Бронхиальная астма у детей. Стратегия лечения и профилактика». Гиперчувствительный пневмонит диагностировали в соответствии с критериями, приведенными в «Классификации основных клинических форм бронхолегочных заболеваний у детей» (2008), диагноз аллергического бронхолегочного аспергиллеза устанавливали в соответствии с критериями Patterson R. и Greenberger Р.А. (1986–1987). Хотя в МКБ-10 существует только диагноз аллергического бронхолегочного аспергиллеза, но спектр этих заболеваний шире и в последующем, говоря об аллергическом бронхолегочном аспергиллезе, мы подразумеваем и иные аллергические бронхолегочные микозы, обусловленные сенсибилизацией к другим видам грибов.

Аллергологическое и иммунологическое обследование детей проводили в иммуно-бактериологической лаборатории (зав. – к.б.н. З. В. Запорожцева) и в НИЛ общей патологии. Для оценки гуморального иммунитета определяли концентрации сывороточных иммуноглобулинов А, М, G и E методом иммуноферментного анализа.

Оценка гиперчувствительности к грибам методом хемилюминесценции [14, 15]

Для повышения достоверности результатов регистрировали хемилюминесценцию образцов попарно (независимо приготовленных из исходной суспензии нейтрофилов), определяли среднее арифметическое и доверительный интервал с 95% уровнем вероятности.

Нами была разработана модификация метода, позволившая повысить его чувствительность. Для оценки эффективности усовершенствованной модификации метода измерение спектров хемилюминесценции проводили параллельно как в стандартной системе in vitro (взвесь нейтрофилов крови в стандартной концентрации – 2х10⁶ кл/мл в растворе Хенкса), так и в модифицированной системе (взвесь нейтрофилов в аутологичной плазме). Во втором случае присутствие в системе антител к аллергенам усиливало фагоцитарную реакцию при добавлении соответствующего антигена грибов (за счет опсонизации антигена).

Оценивали следующие параметры, наиболее информативные для характеристики спектра хемилюминесценции взвеси нейтрофилов:

Imaxl – максимальная интенсивность сигнала хемилюминесценции взвеси нейтрофилов в присутствии стандартного количества люминола;
Imaxn – максимальная интенсивность сигнала хемилюминесценции взвеси нейтрофилов при добавлении раствора аллергенов грибов в присутствии стандартного их количества;
Imax – индекс увеличения максимальной величины хемилюминесценции, равный отношению Imaxn/Imaxl;
Sl – интеграл хемилюминесценции взвеси нейтрофилов в присутствии стандартного количества люминола в течение стандартного отрезка времени (1200 с);
Sn – интеграл хемилюминесценции взвеси нейтрофилов при добавлении раствора аллергенов грибов в присутствии стандартного количества люминола в течение стандартного отрезка времени (1200 с);
S – индекс возрастания интеграла кривой хемилюминесценции, равный отношению Sn/Sl.
Ln – натуральный логарифм

Статистическую обработку полученных данных выполняли на персональном компьютере с использованием пакета прикладных программ Microsoft Excel 2007, «Биостат».

Результаты и обсуждение

Снижение интенсивности хемилюминесценции лейкоцитов в нагрузочном тесте с зимозаном было показано у 9 (15%) из 60 детей. Достоверной реакции в ответ на «нагрузку» не было зарегистрировано у 34 (56,7%), стимулирующий эффект зимозана выявлен у 17 (28,3%) больных. Существенных различий числа проб с разной реакцией на «нагрузки» у детей с бронхиальной астмой, гиперчувствительным пневмонитом и аллергическим бронхолегочным аспергиллезом не выявлено. Влияние опсонизированного зимозана на нейтрофилы крови у детей с хроническими заболеваниями было неоднозначным [6, 8]. Так, установлено, что наиболее частое и глубокое ослабление фагоцитирующей функции нейтрофилов наблюдается при гиперчувствительном пневмоните, а для больных бронхиальной астмой, напротив, характерна активация фагоцитоза. При воздействии зимозана (табл. 1) не получено достоверно значимых различий показателей хемилюминесценции нейтрофилов периферической крови у детей с аллергическими бронхолегочными заболеваниями.

Таблица 1. Средние показатели хемилюминесценции нейтрофилов периферической крови у детей с аллергическими бронхолегочными заболеваниями в нагрузочном тесте с зимозаном (натуральный логарифм Ln) (–X±m)

Нами были проанализированы показатели хемилюминесценции нейтрофилов периферической крови у детей в нагрузочных тестах с аллергенами разных видов грибов. Стимулирующий эффект аллергенов A. fumigatus в нагрузочном тесте in vitro по показателю Imax выявлен у 11 (18,3%), A. alternata – у 19 (31,6%), C. herbarum – у 14 (23,3%), C. albicans – у 18 (30,0%), P. notatum – у 17 (28,3%) из 60 обследованных. Стимулирующий эффект грибковых аллергенов в нагрузочном тесте in vitro по показателю S показан соответственно у 18 (30%), 19 (31,6%), 28 (46,6%), 22 (36,6%), 22 (36,6%) из 60 обследованных детей.

Величина Imax была наибольшей в нагрузочном тесте с аллергенами A. fumigatus; при этом значение показателя было достоверно выше, чем при нагрузке аллергенами C. herbarum и P. notatum (p<0,05 и p<0,05 соответственно). Достоверных различий показателя S в нагрузочных тестах с аллергенами различных грибов не выявлено.

Показатели хемилюминесценции нейтрофилов периферической крови у детей в нагрузочных тестах с аллергенами грибов представлены в табл. 1.

Для приближения реакции к физиологическим условиям раствор Хенкса (стандартный тест) в модифицированном нами варианте был заменен аутологичной плазмой (тем самым мы вводили в систему антитела к грибам, если таковые у больного имелись).

Соотношение показателей Imax и S в стандартном и модифицированном тестах представлено в табл. 2.

Таблица 2. Показатели хемилюминесценции нейтрофилов у детей с аллергическими бронхолегочными заболеваниями в стандартном и модифицированном нагрузочных тестах с грибковыми аллергенами in vitro

Значение S в модифицированном нагрузочном тесте было выше, чем в стандартном, при «нагрузке» аллергенами P.notatum (p<0,05). Число положительных проб в стандартном и модифицированном тестах с аллергенами грибов одного и того же вида было аналогичным. В большинстве положительных проб соответствующие показатели были выше в модифицированном тесте, чем в стандартном.Нами были сопоставлены показатели хемилюминесценции нейтрофилов в стандартном и модифицированном нагрузочных тестах. Показано, что показатель Imax при «нагрузке» аллергенами C. herbarum в модифицированном тесте был достоверно (p<0,05) выше, чем в стандартном; кроме того, его значение достоверно (p<0,05) превышало показатель, полученный при «нагрузке» аллергенами A. Alternata (табл.2)

Таким образом, модифицированная нами методика позволила повысить чувствительность тестирования, в частности с ее помощью показано увеличение параметров хемилюминесценции в тесте с аллергенами C. herbarum и P. notatum.

Результаты исследования позволяют утверждать, что микрометод хемилюминесцентного определения функциональной активности нейтрофилов крови может быть перспективным для изучения повышенной чувствительности лейкоцитов к аллергенам грибов и, следовательно, адекватной диагностики и дифференцированной терапии аллергических заболеваний легких у детей, ассоциированных с грибковой сенсибилизацией.

Список литературы:

1. Котов В. С., Ружицкая Е. А., Мизерницкий Ю. Л., Миненкова Т. А., Окунева Т. С. Роль сенсибилизации к антигенам грибов рода Cladosporium при аллергических заболеваниях легких у детей. Рос. вестн. перинатол. и педиатрии, 2008:53:2:45–54.
2. Семенов А. В. Актуальность хемилюминесцентного метода исследования в медицине. Часть 1: свободные радикалы (классификация, образование, характеристика). Клинико-лабораторный консилиум 2011: 4: 55–6
3. Игнатов П. Е. Иммунитет и инфекция.– М.: Время, 2002, 352 с.
4. Маянский А. Н., Маянский Д. Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге. – Новосибирск, 1989, 344 с.
5. Гурвич А. А. Проблема митогенетического излучения как аспект молекулярной биологии. – АМН СССР-Ленинград: Медицина, 1968. 241 с.
6. Биохимия: учебник для ВУЗов под ред. Е. С. Северина. 5-е издание, 2009 год, 768 с.
7. Владимиров Ю. А. Сверхслабые свечения при биохимических реакциях. (1966) Москва: Наука, 126 с.
8. Владимиров Ю. А., Проскурина Е. В. Свободные радикалы и клеточная хемилюминесценция. Успехи современной химии. 2009:49341– 49388.
9. Harman D. (1956). «Aging: a theory based on free radical and radiation chemistry». Journal of Gerontology. 11 (3): 298–300. doi:10.1093/ geronj/11.3.298. PMID 13332224.
10. Меныцикова Е. Б., Ланкин В. З., Зенков Н. К. и др. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. М.: Фирма «Слово», 2006. 556 с.
11. Мизерницкий Ю. Л., Антонов В. Б. Респираторные микозы у детей: диагностика и терапия. Пульмонология детского возраста: проблемы и решения» (под ред. Ю. Л. Мизерницкого и А. Д. Царегородцева). М: «Медпрактика-М», 2011; Вып. 11: 94–117
12. Faria A., Persaud SJ 2. Cardiac oxidative stress in diabetes: Mechanisms and therapeutic potential. Pharmacol Th er. 2016 Dec 1. pii: S0163–7258(16)30239-X. doi: 10.1016/j. pharmthera.2016.11.013. [ ahead of print]
13. Harman D 1. Free radical theory of aging: an update: increasing the functional life span. Ann N Y Acad Sci. 2006 : 1067:10–21.
14. Алексеева О. Г., Дуева Л. А. Аллергия к промышленным химическим соединениям, М., 1978, 278 с.
15. Дуева А. А., Мизерницкий Ю. Л. Сенсибилизация к промышленным химическим аллергенам при бронхиальной астме у детей в условиях загрязнения окружающей среды. Журнал «Медицина, труд и промышленная экология», 1997: 2: 41–44.

Комментарии