Реалии современной аллергодиагностики: от традиционных методов к молекулярным технологиям

А.Г. Сухотина¹, Г.А. Новик², д-р мед. наук, профессор, О.Б. Тамразова^1,3, д-р мед. наук, профессор, М.В. Жданова², канд. мед. наук, А.С. Стадникова¹, канд. мед. наук, И.Е. Турина⁴, канд. мед. наук

¹ ГБУЗ «Детская городская клиническая больница им. З.А. Башляевой Департамента здравоохранения г. Москвы»
²ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» Минздрава России, г. Санкт-Петербург
³ФГБОУ ДПО «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования» Минздрава России, г. Москва
⁴ФГБОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России, г. Москва

Ключевые слова: аллергические заболевания, аллергодиагностика, компонентная диагностика, тест активации базофилов, тест дегрануляции тучных клеток.
Keywords: allergic diseases, allergy diagnostics, component-resolved diagnostics, basophil activation test, mast cell degranulation test

Резюме. Современные аллергические заболевания представляют собой гетерогенную группу иммунологических патологий, требующих точной диагностики для выбора адекватной терапии. В статье рассмотрены классические методы аллергодиагностики (кожные тесты, определение общего и специфического IgE, провокационные пробы), а также новейшие молекулярные технологии, включая компонент-разделенную и мультиплексную диагностику. Особое внимание уделено тестам активации базофилов и дегрануляции тучных клеток, позволяющим повысить точность выявления причинно-значимых аллергенов. Подчеркивается значение правильной интерпретации результатов для профилактики гипердиагностики и назначения необоснованных диет. Представленные данные подтверждают необходимость комплексного подхода к аллергодиагностике в педиатрической практике, включая использование молекулярных методов в сочетании с клинической оценкой, что позволяет повысить эффективность лечения и улучшить прогноз у пациентов детского возраста.

Summary. Allergic diseases are a heterogeneous group of immune-mediated disorders requiring accurate diagnostics for adequate therapy selection. This article reviews classical diagnostic approaches, including skin testing, measurement of total and specific IgE, and provocation tests, alongside novel molecular technologies such as component-resolved and multiplex allergy diagnostics. Particular attention is given to basophil activation tests and mast cell degranulation assays, which improve the accuracy of identifying clinically relevant allergens. Emphasis is placed on the correct interpretation of diagnostic results to avoid overdiagnosis and unnecessary elimination diets. The findings highlight the importance of an integrated approach in pediatric practice, combining molecular diagnostics with clinical evaluation, thereby increasing treatment efficacy and improving outcomes in children with allergic diseases.

Для цитирования: Реалии современной аллергодиагностики: от традиционных методов к молекулярным технологиям / А.Г. Сухотина [и др.] // Практика педиатра. 2025. № 4. С. 56-64.
For citation: The realities of modern allergodiagnostics: from traditional methods to molecular technologies / A.G. Sukhotina [et al.] // Pediatrician's Practice. 2025;(4): 56-64. (In Russ.)

ВВЕДЕНИЕ

Аллергические заболевания составляют генетически неоднородный кластер иммунологически опосредованных заболеваний, включающий бронхиальную астму, пищевую аллергию, аллергический ринит, аллергический конъюнктивит и атопический дерматит [1]. Во многих странах отсутствуют медицинские службы, предоставляющие экспертную помощь при аллергии [4]. Крупнейшие профессиональные организации, специализирующиеся на проблемах аллергии, - Американская академия аллергии, астмы и иммунологии (AAAAI), Американский колледж аллергии, астмы и иммунологии (ACAAI), Европейская академия аллергии, астмы и клинической иммунологии (EAACI), а также Всемирная аллергологическая организация (WAO) - подчеркивают необходимость активного просвещения как медицинского сообщества, так и широкой общественности относительно значимости аллергических заболеваний в контексте глобального бремени болезней и проблем общественного здравоохранения [4].

За последние несколько десятилетий распространение аллергических заболеваний имеет тенденцию к росту, и, по имеющимся данным, 22% из 1,39 миллиарда человек в 30 странах страдают каким-либо типом аллергического заболевания [1]. Было высказано предположение, что распространенность аллергических заболеваний достигла плато в странах с высоким уровнем дохода, в то время как она все еще растет в странах с низким и средним уровнем дохода [2]. Однако причины этого роста пока не полностью установлены, а глобальное распределение аллергических заболеваний имеет существенную изменчивость. Эта изменчивость может быть объяснена методологическими и популяционными различиями, факторами риска и «экологическими триггерами», которые колеблются в зависимости от географических и социально-экономических условий [5]. Исследование International Study of Asthma and Allergies in Childhood (ISAAC) было разработано для стандартизации сбора эпидемиологических данных, связанных с аллергическим ринитом, астмой и атопическим дерматитом. Исследователи ISAAC-III заявили, что распространенность аллергических заболеваний может быть выше среди населения с более низкими социально-экономическими условиями [5].

Как правило, аллергические заболевания чаще возникают в детском, чем во взрослом возрасте, поэтому больные дети вносят наибольший вклад в рост распространенности аллергических заболеваний, чем больные взрослые [2].

Известно, что аллергические заболевания в основном обусловлены воспалением 2-го типа, опосредованным Th2-клетками [3]. Когда люди с аллергическими заболеваниями подвергаются воздействию аллергенов, их эпителиальные клетки начинают секретировать IL-25, IL-33 и TSLP, что приводит к активации дендритных клеток, которые в свою очередь способствуют дифференциации аллерген-специфических Th2 клеток [3]. Активированные аллерген-специфические Th2 клетки могут не только способствовать выработке аллерген-специфического IgE В-клетками, но и также активировать базофилы, тучные клетки и эозинофилы путем секреции ИЛ-4, ИЛ-5 и ИЛ-13 [3]. Таким образом, аллерген-специфические Th2 клетки играют ключевую роль в развитии аллергических реакций.

Диагностика аллергических заболеваний осуществляется комплексно и включает как неспецифические (общее клинико-лабораторное обследование), так и специфические методы обследования [6]. Специфическая диагностика аллергических заболеваний традиционно складывается из ряда последовательных этапов: сбор аллергологического анамнеза, специфическая клиническая аллергодиагностика in vivo (проведение кожных проб и/или провокационных тестов с аллергенами), иммунологическое и аллергологическое лабораторное обследование in vitro [6]. За последнее десятилетие в области лабораторной диагностики аллергии произошли значимые изменения, обусловленные внедрением новейших молекулярных методов [6]. Вместе с тем существует множество объективных и субъективных обстоятельств, обусловливающих сложности аллергодиагностики.

Неправильная интерпретация или неадекватное применение результатов аллергологической диагностики может привести к необоснованному назначению элиминационных диет, а также способствовать отсрочке обращения к врачу-аллергологу, что, в свою очередь, увеличивает риск хронизации симптомов и нарушает качество жизни пациентов. Сложности диагностики аллергических заболеваний нередко обусловлены полисенсибилизацией, когда традиционных методов обсле дования (аллергоанамнез, кожные пробы или определение специфических иммуноглобулинов E) недостаточно для выявления причинно-значимого или истинного аллергена. Таким образом, именно при помощи аллергодиагностики врач подтверждает или опровергает наличие аллергического заболевания, а также определяет причинно-значимые аллергены. На основании этого он может подобрать корректную терапию и дать рекомендации о том, как избегать взаимодействий с триггерами аллергии.

ТИПЫ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ

В настоящее время выделяют несколько специфических типов реакций гиперчувствительности, каждая из которых характеризуется уникальными иммунологическими механизмами.

Тип I гиперчувствительности - это немедленная реакция, опосредованная иммуноглобулином E (IgE), и включает две основные фазы: фазу сенсибилизации и эффекторную фазу [21]. В фазе сенсибилизации ключевую роль играют сигнальные молекулы Th2-лимфоцитов, которые регулируют продукцию аллерген-специфических IgE-антител (sIgE). При повторном контакте с аллергеном, в эффекторной фазе, происходит перекрестное связывание аллергенов с рецепторами IgE на поверхности тучных клеток и базофилов, что приводит к их дегрануляции. В процессе дегрануляции высвобождаются медиаторы воспаления, включая гистамин, цитокины и хемокины, что вызывает воспаление и типичную клиническую симптоматику аллергической реакции.

Реакции по типу I характерны для таких состояний, как аллергический риноконъюнктивит, бронхиальная астма, крапивница, ангионевротический отек, пищевая, лекарственная и инсектная аллергия, а также, по современным данным, могут быть вовлечены в патогенез болезни Альцгеймера [21]. Несмотря на то что именно тип I ассоциируется с «классической аллергией», он не является единственным механизмом гиперчувствительности.

Гиперчувствительность по типу II обусловлена участием иммуноглобулинов классов IgG и IgM, которые распознают антигены, локализованные на поверхности клеток организма [21]. Образование иммунных комплексов активирует классический путь комплемента и/ или привлекает эффекторные клетки (NK-клетки, макрофаги, нейтрофилы) через рецепторы Fcγ(FcγR), что приводит к цитолизу мишеней. Наиболее частой причиной реакций типа II являются лекарственные препараты, способные ковалентно связываться с белками мембран клеток-хозяина, формируя иммуногенные комплексы [21]. Заболевания, патогенез которых включает гиперчувствительность II типа, включают: аутоиммунную гемолитическую анемию, иммунную тромбоцитопению, аутоиммунную нейтропению, болезнь Бирмера, синдром Гудпасчера, эритробластоз плода, миастению, пузырчатку, а также гемотрансфузионные реакции при несовместимости по группам крови [21].

Реакции гиперчувствительности III типа развиваются, как правило, через 3-10 часов после экспозиции к антигену. Основной механизм заключается в образовании циркулирующих иммунных комплексов между растворимыми антигенами и антителами (в основном класса IgG), которые оседают в тканях и активируют комплемент, приводя к воспалительному повреждению тканей [21]. К клинически значимым состояниям, связанным с гиперчувствительностью III типа, относятся: острая гиперчувствительность, лекарственный васкулит, септицемия, реакция Артюса, системная красная волчанка (СКВ) и ревматоидный артрит (РА).

Согласно обновленной классификации EAACI, тип IV гиперчувствительности подразделяется на субтипы IVa, IVb и IVc, опосредованные соответственно Th1, Th2 и Th17 лимфоцитами [22]. При воздействии экзогенного или эндогенного антигена развивается локальная воспалительная реакция с привлечением макрофагов и моноцитов, которые презентируют антиген Т-лимфоцитам [22]. Активация Т-клеток сопровождается секрецией цитокинов и хемокинов, запускающих воспаление. К заболеваниям, обусловленным реакциями IV типа, относятся: аллергический контактный дерматит и гиперчувствительность к лекарственным препаратам.

Тип V - гиперчувствительность, связанная с дефектом эпителиального барьера. Нарушение целостности эпителиального барьера активирует иммунный ответ с высвобождением аларминов, таких как IL 33, IL 25 и тимусный стромальный лимфопоэтин (TSLP) [21]. Эти сигнальные молекулы стимулируют ответ Th2-клеток, что способствует развитию аллергического воспаления.

Гиперчувствительность VI типа связана с иммунной дисрегуляцией, вызванной ожирением. Избыточная масса тела способствует увеличению концентрации провоспалительных цитокинов, нейтрофилов, эозинофилов в периферической крови, а также повышению уровня острофазовых белков, активных форм кислорода и хемокинов, участвующих в развитии хронического воспаления, ассоциированного с повышенным индексом массы тела (ИМТ) [21].

Гиперчувствительность VII типа обусловлена неиммунологической активацией клеточного ответа на химические агенты. Основной механизм включает ингибирование фермента циклооксигеназы 1 (COX 1) с последующим увеличением синтеза производных арахидоновой кислоты - лейкотриенов (LTC4, LTD4, LTE4) [25, 26]. Это сопровождается снижением продукции простагландинов и усилением воспаления. Тип VII характерен для реакций на нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) и другие химические вещества, вызывающие острые воспалительные ответы.

ДИАГНОСТИКА

Сбор аллергологического анамнеза занимает ключевое место в алгоритме аллергодиагностики, являясь первичным и наиболее доступным инструментом верификации аллергической природы заболевания. Основной задачей анамнеза является идентификация признаков, указывающих на иммунологически опосредованный характер патологического процесса. Аллергологический анамнез включает уточнение наследственной предрасположенности к атопическим и аллергическим заболеваниям, наличие ранее перенесенных аллергических реакций и состояний, а также выявление ведущих клинических симптомов и синдромов. Кроме того, оценивается эффективность ранее применявшихся противоаллергических препаратов, наличие сезонной зависимости симптоматики, а также характер реакции на устранение предполагаемого аллергена (элиминационный эффект) [7]. На данном этапе также могут быть выявлены аллергены, наиболее вероятно участвующие в реализации аллергических заболеваний [7]. Таким образом, тщательно собранный анамнез является отправной точкой, определяющей последовательность и объем последующего тестирования in vivo и in vitro.

Постановка кожных тестов является диагностическим методом выявления специфической сенсибилизации организма путем введения через кожу аллергена и оценки величины и характера развившегося при этом отека или воспалительной реакции [8]. Существуют разные методы кожного тестирования с аллергенами in vivo: прик-тесты, скарификационные тесты, аппликационные тесты, внутрикожные тесты [8]. Кожные тесты - это диагностический метод выявления специфической сенсибилизации организма. Для проведения кожного тестирования используются стандартные серийные аллергены, содержащие 10 000 единиц белкового азота (protein nitrogen unit, PNU) в 1 мл, изготовленные из пыльцы растений, домашней пыли, шерсти, пуха, эпидермиса животных и птиц, пищевых продуктов и другого сырья [8]. Показанием для проведения кожных тестов являются данные анамнеза, указывающие на причинную роль того или иного аллергена или их группы в развитии заболевания [8]. К преимуществам метода относятся: доступность, инвазивность, быстрое и наглядное получение результатов [8]. Также данный метод диагностики имеет ряд противопоказаний, к которым относятся обострение заболевания; тяжелое декомпенсированное течение бронхиальной астмы (объем форсированного выдоха за 1-ю секунду <70%); острые интеркуррентные инфекционные заболевания, например ОРВИ; декомпенсация заболеваний внутренних органов; обострение хронических, инфекционных и аутоиммунных заболеваний; первичные иммунодефицитные состояния; развитие анафилактического шока при проведении кожного тестирования в анамнезе; злокачественные новообразования; ВИЧ-инфекция/СПИД; психические заболевания, при которых затруднен контакт с пациентом [8]. При проведении кожных тестов возможны ложноположительные результаты, причинами которых являются неправильные дозы аллергенов, технические ошибки, дермографизм, остаточные явления предшествующей аллергической реакции или совпадение с началом новой аллергической реакции, соответствие клинической картине (субъективное заключение специалиста) [8].

Диагностика аллергии in vitro выявляет сенсибилизацию к аллергическим заболеваниям с помощью образцов крови и в значительной степени зависит от качества и точности клинических лабораторных исследований. Клинические лабораторные исследования имеют важное значение для современного здравоохранения, обеспечивая точную диагностику, лечение и контроль заболеваний.

• Тестирование иммуноглобулина Е (IgE)

Для постановки диагноза важное значение придается определению общего IgE, который вырабатывается плазматическими клетками миндалин, селезенки, желудка, слизистых оболочек - дыхательных путей и кишечника [9]. Исследованиями доказано, что IgE способен быстро присоединяться к поверхности тучных клеток и базофилов кожи и слизистых оболочек [9]. При повторном контакте с антигеном (аллергеном) его связывание с антителами приводит к дегрануляции этих клеток с высвобождением вазоактивных веществ (гистамина, серотонина, гепарина и др.) и запуском аллергической реакции (типа I, немедленного типа) [9]. Еще одна функция иммуноглобулинов класса Е - участие в ответной реакции при заражении паразитами (аскаридами, нематодами, описторхами, трихинеллами и др.) [9]. При этом происходит непосредственное - взаимодействие с антигенами возбудителя [9]. Следует отметить, что тест на общий IgE в крови в основном используется в качестве скрининга для выявления аллергии, однако для поиска причинного аллергена необходимо выявление специфических к нему IgE [9].

• Аллерген-специфические IgE-тесты

Одноплексная (однокомпонентная) диагностика

Исследование выполняется как для отдельных аллергенов, так и для комплексов аллергенов (панелей) [10]. Наиболее распространенным методом выявления sIgE к аллергенам является иммуноферментный анализ (ИФА) [10]. С помощью ИФА определяется количество sIgE к аллергенам клещей домашней пыли и животных, грибковым, пыльцевым, пищевым и лекарственным аллергенам in vitro в сыворотке крови [10]. В основе метода лежит специфическая реакция антигена и антитела, когда они образуют иммунные комплексы, которые выявляются с помощью фермента в качестве метки для регистрации сигнала, которым предварительно метится один из компонентов (антиген или антитело) [10]. Уровни специфического IgE-связывания определяются по интенсивности свечения. Чем сильнее свечение по отношению к негативному контролю (сыворотка, в которой отсутствует sIgE), тем больше sIgE в сыворотке пациента [10]. Концентрация sIgE выражается количественно в международных единицах МЕ/мл [10] (рис. 1).

Рис. 1. Механизм действия определения специфических IgE иммуноферментным анализом (ИФА)

Одним из современных методов лабораторной диагностики иммунологического профиля является имму-нохемилюминесцентный анализ (ИХЛА) [10]. В ИХЛА используется иммунологическая реакция, где в качестве субстрата присоединяются люминофоры - вещества, светящиеся в ультрафиолете [10]. Итоги реакции расцениваются по наличию хемилюминесцентного свечения, интенсивность которого пропорциональна концентрации sIgE в сыворотке крови [10]. Большой популярностью пользуется автоматизированный иммунный анализ, основанный на явлении хемилюминесцентного свечения [10] (рис. 2). Характеристики автоматических иммуноанализаторов отличаются широтой диапазона тестов, производительностью более 100 тестов в час, возможностью выполнения экстренных исследований, хранением калибровочных кривых, что исключает необходимость проводить неоправданно частые калибровки лабораторного оборудования [10]. Несмотря на ряд преимуществ, ИХЛА имеет и ряд недостатков, главный из которых - высокая стоимость исследования [10].

Рис. 2. Определение специфических IgE методом иммунохемилюминесцентного анализа (ИХЛА): подробный механизм работы

В настоящее время тест-система «ImmunoCAP» (Швеция) наиболее широко используется в ведущих аллергологических клиниках США, Европы, Японии и фактически является золотым стандартом лабораторной аллергодиагностики, с которым сравниваются другие методы [10]. Идея технологии заключается в возможности обнаружения в сверхмалом количестве крови пациента сверхнизких концентраций sIgE (предел количественного определения составляет 0,1 kU/l, хотя до недавнего времени не было возможности точно измерить уровень ниже 0,35 kU/l). Технически это реализуется путем использования специального вспененного материала, производного бромциан-активированной целлюлозы. Благодаря своей пористой структуре материал имеет большую поверхность взаимодействия и обеспечивает высокую константу связывания с нанесенным на него антигеном или антителом. Площадь поверхности такого материала (сорбционная емкость твердой фазы) в 150 раз больше внутренней поверхности обычной лунки или пробирки [10].

Тест «Phadiatop» широко используется в странах Европы, США, Китае, Японии и др. «Phadiatop» и «Phadiatop Infant» представляют собой сбалансированные смеси аллергенов, наиболее часто участвующих в возникновении А3 у взрослых и детей [11]. «Phadiatop Infant» (Фадиатоп детский) представляет смесь аллергенов пыльцы сорных и злаковых трав, деревьев; перхоти кошки, собаки и лошади; плесени, клеща домашней пыли; белка куриного яйца, молока, рыбы, пшеницы, арахиса, сои и применяются для детей до 4 лет. «Phadiatop» представляет смесь ингаляционных аллергенов, используется для диагностики респираторной аллергии у взрослых и детей старше 4 лет [11]. Тест дает качественный результат: положительный или отрицательный в зависимости от реакции флуоресценции [11]. Если образец пациента дает флуоресцентный ответ, превышающий или равный ответу контрольной сыворотки, это свидетельствует о положительном результате теста [11]. В соответствии с рекомендациями производителя «Phadiatop» и «Phadiatop Infant» являются начальными скрининговыми тестами, полезными для выявления пациентов с высокой вероятностью А3 [11]. Клиническая эффективность теста «Phadiatop» выражается в чувствительности в диапазоне от 84 до 95% и специфичности в диапазоне от 85 до 94%, что подтверждено в многоцентровых исследованиях с участием нескольких сотен пациентов [11].

Мультиплексная (многокомпонентная) диагностика

Мультиплексные тесты основаны на определении концентрации sIgE для множества различных компонентов аллергена в одном тесте [12]. Использование мультиплексных методов может помочь выявить виды перекрестной сенсибилизации, а также определить потенциально высокие риски аллергены [12]. В настоящее время существует две основные мультиплексные системы, которые измеряют >100 или 300 отдельных аллергенов - микрочип ISAC (Immuno Solid-phase Allergy Chip) и тест ALEX 2 (Allergy Explorer 2), которые различаются профилем аллергенов, иммунохимической технологией, методом регистрации результатов и объемом сыворотки, необходимой для проведения теста [12].

Микрочип ISAC - это миниатюризованная платформа с очищенными натуральными и рекомбинантными компонентами аллергенов, предназначенная для измерения специфических IgE/IgG-антител в 30 мкл сыворотки или плазмы [10]. Результаты теста - это моментальная характеристика профиля сенсибилизации пациента, охватывающая специфическую и перекрестно реактивную сенсибилизацию [10]. Ранняя версия микроматрицы содержала 103 компонента аллергенов, последнее поколение микроматриц ISAC содержит 112 специфических и перекрестно реактивных компонентов аллергенов, включая маркеры риска пищевой аллергии, специфические маркеры пыльцы, клещей, животных, плесневых грибов, ракообразных и ядов насекомых, а также маркеры сенсибилизации к перекрестно реактивным карбогидратным детерминантам (CCDs) [10]. В состав теста включены аллергокомпоненты из различных белковых групп с разными свойствами и способностью вызывать аллергическую реакцию [10]. Результаты теста определяются полуколичественно в стандартизированных единицах ISAC Standardized Units (ISU) с помощью сканера биочипов и оцениваются с помощью специального программного обеспечения [10]. Польза от ISAC продемонстрирована при диагностике большинства аллергических заболеваний [10]. Этот метод предоставляет врачам полную картину профиля сенсибилизации пациента в результате одного теста, а также информацию о специфической и перекрестно реактивной сенсибилизации для упрощения постановки диагноза, оценки риска развития реакций, связанных с определенными аллергенами [10]. Широкий спектр аллергенов на микроматрице помогает выявить неожиданную сенсибилизацию к аллергенам, которые обычно не исследуются, но могут быть причиной симптомов или нести риск развития тяжелых реакций [10]. Эти данные могут помочь с отбором пациентов и подходящих аллергенов для АСИТ в отличие от тестов на основе экстрактов, а также прогнозировать ответ на лечение [10].

Тест ALEX 2 (Вена, Австрия) является современным многокомпонентным твердофазным иммуноферментным анализом, основанным на технологии использо вания наночастиц (наносфер) в качестве носителей аллергена [13]. Использование технологии наночастиц в качестве носителей аллергенов позволяет диагностической системе легко модифицировать профиль аллергенов путем замены одной молекулы на другую [13]. Сегодня тест ALEX 2 способен одновременно просчитывать концентрации sIgE для 300 аллергенов, включая 180 молекул и 120 экстрактов, из большинства семейств ингаляционных аллергенов и перекрестно-реактивных пищевых продуктов [13]. Для проведения теста необходима сыворотка или плазма в объеме всего 100 мкл, а сама аналитическая процедура занимает 3,5 часа [13] (рис. 4). Немаловажной особенностью теста является и то, что пациенту не нужно прекращать прием каких-либо лекарств для проведения диагностики, что особенно актуально в случаях с некупируемыми самостоятельно симптомами аллергических заболеваний [13].

Рис. 4. Принцип действия теста ALEX2

В целом мультиплексная (многокомпонентная) диагностика устраняет необходимость в предварительном выборе аллергенов и особенно полезна для пациентов с аллергией, которую трудно диагностировать, например идиопатическая анафилаксия или полисенсибилизация, где они дают исчерпывающую картину профиля сенсибилизации пациента [14]. Данная диагностика требует небольшого объема сыворотки крови пациента и является менее затратным методом по сравнению с одноплексными подходами [14].

Клеточные методы диагностики сенсибилизации

Тест активации базофилов (ТАБ) - это функциональный анализ проточной цитометрии, основанный на измерении активации циркулирующих базофилов при стимуляции in vitro живых клеток крови специфическими аллергенами [15]. Данный тест оценивает перекрестное связывание IgE, будучи более точным, чем прямое измерение концентрации циркулирующего аллерген-специфического IgE [15]. Будучи полностью проанализированным in vitro, он представляет собой многообещающую альтернативу провокационному тесту, учитывая, что он менее инвазивный, более безопасный и дешевый [15]. В настоящее время ТАБ назначается, когда рутинные клинические (кожные прик-тесты) и лабораторные (определение sIgE) анализы дают неоднозначные или противоречивые результаты относительно анамнеза пациента и/или если введение аллергена представляет для пациента релевантный риск [15]. Таким образом, ТАБ имеет огромный потенциал в диагностике клинически значимых пищевых и лекарственных аллергий, а также у пациентов, страдающих хронической крапивницей; он также успешно применяется при последующем наблюдении за результатами аллергенспецифической иммунотерапии [15]. Принцип метода ТАБ построен на том, что базофилы экспрессируют полную тетрамерную форму высокоаффинного рецептора к IgE - FcέRI [16]. При повторном попадании аллергена в организм происходит его связывание со специфическим IgE, находящимся на поверхности базофилов [16]. Перекрестное связывание аллергеном специфического IgE запускает процесс активации базофилов, который, помимо высвобождения вазоактивных медиаторов, сопровождается усилением экспрессии молекул на поверхности клетки, а также появлением новых молекул, которые ранее были включены в мембрану базофильных гранул [16]. Схема постановки метода включает инкубацию базофилов со специфическими (аллергеном) и неспецифическими (положительный контроль) веществами, добавление моноклональных антител для идентификации базофилов и оценки процесса их активации, лизирование эритроцитов с последующей отмывкой и учетом на проточном цитометре [16]. Обычно для каждого тестируемого аллергена можно использовать как экстракты, так и молекулярные компоненты [14]. 50100 мкл крови (ЭДТА/гепарин) смешивают с аллергеном и антителами, инкубируют при температуре 37 °C в течение 15-45 мин, затем образец гемолизируют и анализируют с помощью проточной цитометрии [14]. Базофилы сначала идентифицируются с помощью конъюгированных с флуорохромом антител, нацеленных на CD193, CD203c, IgE, CCR3+/CD3-, CD123+/HLA-DR- или IgE+/CD203c+, а затем их активация измеряется с помощью CD63 или CD203c, а также альтернативными вариантами, включая CD107a и диаминоксидазу (ДАО) [14] (рис. 3). Тест обычно считается положительным при активации >5-15% базофилов, и индекс стимуляции >2, при разделении с отрицательным контролем, где препараты обычно имеют самые низкие пороги [14]. К основным преимуществам ТАБ относятся гибкость в выборе стимуляторов, что позволяет тестировать практически любое вещество при условии надлежащего контроля, а также повышенная безопасность пациентов за счет подтверждения диагноза без воздействия аллергена. Важно то, что антигистаминные препараты и местные стероиды не влияют на результаты тестов. Установленная возможность индукции экспрессии молекул на базофилах в условиях моделирования аллергической реакции без участия IgE позволяет рассматривать данный процесс как потенциальный механизм, вовлеченный в патогенез не-IgE-зависимых гиперчувствительных реакций. К основным ограничениям ТАБ относят различия в подготовке и источниках аллергенов, а также отсутствие стандартизированных протоколов и требований по использованию ТАБ в диагностических алгоритмах [17]. В целом ТАБ является многообещающим дополнением в качестве дополнительного теста на аллергию второй линии.

Рис. 3. Тест активации базофилов: технология метода

Тест дегрануляции тучных клеток (ТДТК) представляет собой in vitro метод, направленный на количественную и/или качественную оценку степени активации мастоцитов при воздействии специфических аллергенов. В отличие от традиционных диагностических подходов -таких как кожные пробы и определение специфических IgE в сыворотке крови - ТДТК позволяет исследовать функциональную реактивность клеток, что делает его особенно ценным инструментом при диагностике сложных, атипичных или сомнительных случаев аллергии. Наибольшее значение ТДТК имеет в диагностике IgE опосредованных реакций, особенно при противоречивых результатах стандартных тестов. Его применение оправдано при так называемой локальной аллергии, когда сенсибилизация ограничена слизистыми оболочками и не отражается в системных показателях [28], а также при реакциях на низкомолекулярные аллергены, включая лекарственные препараты и гаптены, для которых классические методы малоинформативны [28]. Исследования показали достоверную корреляцию между степенью дегрануляции мастоцитов in vitro и выраженностью клинических реакций на пищевые аллергены, такие как арахис, коровье молоко и морепродукты [29]. Дополнительно ТДТК может применяться для диагностики не-IgЕ-опосредованных состояний, например при непереносимости нестероидных противовоспалительных препаратов, включая аспирин, когда активация тучных клеток связана с нарушением метаболизма арахидоновой кислоты и избыточной продукцией лейкотриенов [30]. Несмотря на высокую диагностическую ценность, ТДТК пока не получил широкого внедрения в рутинную клиническую практику. Основными сдерживающими факторами являются техническая сложность выполнения, необходимость высококвалифицированного персонала и отсутствие общепринятых стандартов проведения теста [31]. В качестве альтернативы рассматривается тест активации базофилов (ТАБ), который благодаря более простой технической реализации и лучшей стандартизации уже нашел применение в ряде клинических и исследовательских центров [32].

Одним из диагностических методов аллергии in vitro является тест бласттрансформации лимфоцитов (ТБТЛ), который основан на активации и расширении Т-клеток памяти, специфичных к лекарственному средству, после совместной инкубации периферических мононуклеарных клеток пациента с предполагаемым лекарственным средством in vitro [18]. Параметром считывания результатов в классическом ТБТЛ является пролиферация Т-клеток, которую можно измерить в виде числа импульсов в минуту после добавления радиоактивно меченого тимидина к клеточной культуре [18]. В настоящее время метод ТБТЛ в основном используется для проверки гиперчувствительности к лекарственным препаратам, однако его чувствительность (27-88,8%) и специфичность (63-100%) сильно варьируются в зависимости от препарата, причем он более эффективен для бета-лактамов и противосудорожных препаратов.

Эозинофилы считаются центральным участником в патогенезе аллергических заболеваний, таких как атопический дерматит, бронхиальная астма и аллергический риноконъюнктивит , а также играют патофизиологическую роль в неаллергических состояниях, включая паразитарные инфекции, эндокринные и аутоиммунные заболевания [19]. Определение количества эозинофилов в периферической крови представляет собой легкодоступный и экономически эффективный тест. Эозинофилия рассматривается как потенциальный биомаркер, ассоциированный с повышенным риском развития бронхиальной астмы, однако ее диагностическая ценность ограничена в силу низкой специфичности, поскольку увеличение числа эозинофилов может наблюдаться при различных других патологических состояниях [20]. Возможный биологический механизм заключается в том, что высокоцитотоксичные белки, хранящиеся в эозинофилах, могут приводить к повреждению тканей при воспалении [20]. В многоцентровом проспективном исследовании, проведенном в Китае, было установлено, что повышенное количество эозинофилов в периферической крови связано с повышенным риском развития бронхиальной астмы [20].

Провокационные пробы

Провокационные пробы в аллергологической диагностике представляют собой методы, при которых в контролируемых условиях пациенту вводят предполагаемый аллерген, с последующей оценкой клинической или клеточной реакции. Использование таких тестов обеспечивает оценку практически «в реальных условиях», позволяя подтвердить или исключить аллергию с высокой степенью достоверности.

Согласно международным обзорам и консенсусным документам, используются следующие типы провокационных проб:

Назальная провокационная проба - специализированный in vivo диагностический тест, при котором аллергены контролируемо вводятся в носовую полость для воспроизведения реакции на уровне слизистой. Метод применяется для подтверждения диагноза аллергического ринита и считается золотым стандартом в случаях расхождения между анамнезом, результатами кожных проб и уровнем специфических IgE [23]. Перед проведением исследования необходимо отменить антигистаминные и сосудосуживающие препараты, а также исключить острые инфекции, полипы и другие воспалительные заболевания полости носа [24]. Для теста используют стандартизированные экстракты аллергенов, которые вводят с помощью микропипетки или спрея в одну либо обе ноздри [24]. Оценка реакции осуществляется как субъективно, так и объективно: субъективные проявления (зуд, чихание, ринорея, заложенность) фиксируются по шкале TNSS (Total Nasal Symptom Score), а объективные данные включают измерение пикового носового вдоха (PNIF), акустическую ринометрию и риноманометрию до и после введения аллергена [24]. Преимуществами метода являются высокая специфичность и орган-ориентированность, так как проба воспроизводит естественный путь контакта аллергена с носовой слизистой и позволяет достоверно выявлять аллергический ринит. Кроме того, тест обладает высокой диагностической точностью, выявляя сенсибилизацию даже при отрицательных кожных пробах или низком уровне специфических IgE в сыворотке, и может использоваться для мониторинга эффективности аллерген-специфической иммунотерапии [24]. Вместе с тем метод имеет ограничения: в разных клиниках применяются различные дозировки, методики и критерии интерпретации, что снижает воспроизводимость результатов. Проведение теста требует специального оборудования (PNIF-измерители, риноманометры, системы акустической ринометрии) и квалифицированного персонала [24]. У пациентов возможен выраженный дискомфорт в виде зуда, чихания, заложенности и развитие поздних реакций, что требует медицинского наблюдения. К противопоказаниям относятся острые инфекционные процессы носоглотки, тяжелая астма, беременность, аллергия на тестируемый аллерген и наличие анафилактических реакций в анамнезе [24].

Конъюнктивальная провокационная проба представляет собой in vivo диагностический метод, при котором стандартизированный аллерген вводится непосредственно на конъюнктиву глаза для воспроизведения IgE-зависимой реакции [25]. Тест применяется для подтверждения аллергического конъюнктивита, особенно у пациентов с сомнительной клиникой, полисенсибилизацией или при расхождении лабораторных и кожных тестов [25]. Перед процедурой проводится офтальмологическое обследование для исключения активного воспаления глаз [25]. Один глаз получает физиологический раствор в качестве контроля, на второй вводится аллерген в нижний конъюнктивальный мешок, часто с использованием четырех последовательных увеличивающихся концентраций экстракта [25]. Реакцию оценивают через 15 минут после каждой дозы с помощью композитного симптомного балла: зуд (0-4), покраснение (0-3), слезотечение (0-3), хемоз (0-3); положительная проба определяется при сумме > 5 баллов [25]. После позитивного результата пациент наблюдается 1-2 часа для выявления поздних реакций [25]. Метод отличается высокой диагностической точностью при подтверждении IgE-опосредованного аллергического конъюнктивита, особенно у полисенсибилизированных пациентов, и служит эффективной альтернативой при сомнительных результатах лабораторных и кожных тестов [25]. Применение стандартизированных экстрактов напрямую на конъюнктиву обеспечивает специфичность и простоту методики, что делает ее полезной для подбора аллергенов при иммуннотерапии и оценки эффективности терапии [25]. Ограничениями являются недостаточная стандартизация доз и критериев интерпретации, необходимость квалифицированного персонала, специализированного оборудования и возможности экстренной помощи, а также потенциальный риск легких системных реакций, назальных симптомов (чихание, ринорея) или интенсивной реакции при ошибке дозировки [25]. Противопоказания включают воспалительные заболевания глаз, тяжелую астму, анафилаксию в анамнезе и беременность [25].

Оральная провокационная проба - это поэтапное пероральное введение пищевого аллергена в возрастающих дозах с интервалом 15-30 минут, в течение установленного промежутка времени, с последующим наблюдением за клинической реакцией организма [26].

Описаны три основных оральных пищевых провокационных теста: открытый (Open Food Challenge - OFC), одиночный слепой (Single-Blind Food Challenge - SBFC) и двойной слепой плацебо-контролируемый (Double-blind, placebo-controlled food challenge - DBPCFC) [26]. При OFC в момент проведения открытой пищевой провокации пациент и врач знают, какой пищевой аллерген анализируется. При проведении SBFC, одиночной слепой пищевой провокации, информацией о составе тестируемого продукта обладает только врач. При DBPCFC, двойной слепой плацебо-контролируемой пищевой провокации, ни пациент, ни врач не знают, в какой пробе находится исследуемый пищевой аллерген. Данная проба считается золотым стандартом диагностики пищевой аллергии, особенно в форме двойной слепой плацебо-контролируемой пробе (DBPCFC) [26]. Во время теста проводится непрерывный мониторинг кожных, желудочно-кишечных и респираторных симптомов. При появлении объективных признаков аллергии тест немедленно прекращается. Метод отличается максимальной достоверностью, так как позволяет с уверенностью подтвердить или исключить пищевую аллергию при противоречивых результатах других тестов, а также определить пороговую дозу аллергена, вызывающую клиническую реакцию, что важно для индивидуализации диетотерапии и оценки риска неблагоприятных иммунных ответов [26]. Проведение успешного теста также снижает страх пациентов перед употреблением ранее избегаемого продукта и может выполняться в амбулаторных условиях. Ограничениями метода являются риск системных реакций, что требует проведения теста только опытными аллергологами с возможностью экстренной помощи, трудоемкость процедуры, особенно при DBPCFC, и ограниченная стандартизация дозирования, критериев интерпретации и методологии, что снижает воспроизводимость и межцентровую сопоставимость данных [26].

Ингаляционная провокационная проба представляет собой функциональный диагностический тест, позволяющий выявить бронхиальную гиперреактивность - ключевой патогенетический показатель при бронхиальной астме. Метод применяется при сомнительном клиническом анамнезе и нормальной базальной спирометрии, а также для оценки активности воспалительного процесса и контроля терапии [24]. Тест проводится с использованием прямых агентов (метахолин, гистамин), которые воздействуют на рецепторы гладкой мускулатуры, вызывая бронхоспазм, либо непрямых агентов (маннитол, физическая нагрузка, гипертонический аэрозоль), которые активируют воспалительные клетки и эпителий дыхательных путей с высвобождением бронхоконстрикторных медиаторов, что более специфично для активной астмы [24]. Процедура выполняется путем вдыхания возрастающих доз через небулайзер или дозируемый ингалятор с последующим измерением объема выдоха за первую секунду (ОФВ1); проба считается положительной при снижении ОФВ1 на > 20% от исходного значения [24]. Метод обладает высокой диагностической ценностью, позволяя выявлять бронхиальную гиперреактивность даже при нормальной функции легких в покое, а также используется для прогнозирования и мониторинга эффективности лекарственной терапии в клинических и фармакологических исследованиях [24]. Ограничениями являются риск бронхоспазма и дискомфорта, требующие наличия оборудования для экстренной помощи, а также необходимость специализированной инфраструктуры и квалифицированного персонала для проведения измерений ОФВ1 [24].

Ни один из перечисленных провокационных тестов в РФ не сертифицирован и не рекомендован в клинических рекомендациях Минздрава РФ в связи с отсутствием в нашей стране стандартизированных аллергенов, необходимых для проведения данного тестирования, и отсутствием утвержденных протоколов проведения данного диагностического исследования.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Аллергодиагностика представляет собой совокупность методов, направленных на выявление причинно-значимых аллергенов, вызывающих патологическую активацию иммунной системы. Основная цель - установление конкретного триггерного фактора (пыльца, пищевые продукты, бытовая пыль, эпидермальные аллергены и др.), ответственного за развитие клинической симптоматики.

Применение методов аллергодиагностики позволяет провести дифференциальную диагностику с другими нозологиями, сопровождающимися сходной клинической картиной, включая инфекционные и дерматологические заболевания. Верификация сенсибилизации к определенным аллергенам служит основой для назначения индивидуализированной элиминационной диеты, а также обоснования необходимости соблюдения мер гипоаллергенного быта.

Современные подходы, в частности использование компонент-разделенной аллергодиагностики, дают возможность отличить истинную (моноспецифическую) сенсибилизацию от перекрестных иммунологических реакций, оценить потенциальный риск анафилактических реакций, а также спрогнозировать эффективность аллерген-специфической иммунотерапии (АСИТ), особенно у пациентов с полисенсибилизацией.

Применение аллергодиагностических методов в динамике при ведении пациентов с пищевой и/или респираторной аллергией позволяет в определенной степени оценить эффективность проводимой терапии и спрогнозировать течение заболевания. Перспективным направлением остается разработка диагностических алгоритмов, позволяющих выявлять сенсибилизацию при не-IgЕ-опо-средованных формах аллергопатологии, что, в свою очередь, может значительно повысить эффективность лечебных вмешательств у данной категории пациентов.

Литература

1. Pathogenesis of Children's Allergic Diseases: Refocusing the Role of the Gut Microbiota / T. Hu [et al.] // Frontiers in Physiology. 2021. Vol. 12. 749544. DOI: 10.3389/fphys.2021.749544.

2. Genuneit J., Standl M. Epidemiology of Allergy: Natural Course and Risk Factors of Allergic Diseases // Handbook of Experimental Pharmacology. 2022. Vol. 268. P. 21-27. DOI: 10.1007/164_2021_507.

3. Th2A cells: The pathogenic players in allergic diseases / Z. Huang [et al.] // Frontiers in Immunology. 2022. Vol. 13. 916778. DOI: 10.3389/fimmu.2022.916778.

4. The importance of allergic disease in public health: an iCAALL statement / M. Sanchez-Borges [et al.] // World Allergy Organization Journal. 2018. Vol. 11, No. 1. P. 8. DOI: 10.1186/s40413-018-0187-2.

5. Prevalence and associated factors of allergic diseases in school children and adolescents aged 6-7 and 13-14 years from two rural areas in Colombia / S. Moreno-Lopez [et al.] // Allergologia et Immunopathologia. 2021. Vol. 49, No. 3. P. 153-161. DOI: 10.15586/aei.v49i3.183.

6. Component allergy diagnostics as a tool for the management of patients with allergic diseases / E.V. Churyukina [et al.] // Russian Journal of Allergy. 2021. Vol. 18, No. 3. P. 105-112. DOI: 10.36691/RJA1432.

7. Хоха Р.Н. Диагностика аллергии: реалии и перспективы. Часть 1 // Журнал Гродненского государственного медицинского университета. 2021. Т. 18, № 3. С. 329-334. DOI: 10.25298/2221-8785-2020-18-3-329-334.

8. Рыбникова Е.А., Продеус А.П., Федоскова Т.Г. Современные подходы к лабораторной диагностике аллергии - в помощь практикующему врачу // РМЖ. Медицинское обозрение. 2021. Т. 5, № 1. С. 43-49. DOI: 10.32364/2587-68212021-5-1-43-49.

9. Мавлянова Ш.З., Муллаханов Ж.Б., Исмагилов А.И. Современные методы диагностики аллергических заболеваний кожи // Juvenis Scientia. 2020. Т. 6, № 3. С. 28-34. DOI: 10.32415/ jscientia_2020_6_3_28-34.

10. Бала А.М., Клещенко А.Б., Чурсинова Ю.В. Современные возможности лабораторной аллергодиагностики // РМЖ. 2019. Т. 1 (II). С. 56-61.

11. Evaluation of the phadiatop test in the diagnosis of allergic sensitization in a general adult population / C. Vidal [et al.] // Journal of Investigational Allergology and Clinical Immunology. 2005. Vol. 15, No. 2. P. 124-130.

12. China Consensus Document on Allergy Diagnostics / H. Chen [et al.] // Allergy, Asthma & Immunology Research. 2021. Vol. 13, No. 2. P. 177-205. DOI: 10.4168/aair.2021.13.2.177.

13. Modern possibilities of allergy diagnostics in real clinical practice / G.A. Novik [et al.] // Russian Journal of Allergy. 2024. Vol. 21, No. 2. P. 321-332. DOI: 10.36691/RJA16937.

14. Arsenis C., Taka S., Skevaki C. Fundamentals of laboratory diagnostics in allergology // Allergo Journal International. 2025. Vol. 34, No. 2. P. 21-30.

15. Applications of basophil activation test in paediatric allergic diseases / D. Giulia [et al.] // World Allergy Organization Journal. 2024. Vol. 17, No. 12. 100998. DOI: 10.1016/j.waojou.2024.100998.

16. Romanova I.V., Goncharov A.E. The Basophil activation test: technology of the method and its application in allergology // Immunopathology, allergology, infectology. 2018. Vol. 1. P. 26-34. DOI: 10.14427/jipai.2018.1.26.

17. Towards an FDA-cleared basophil activation test / O. Alpan [et al.] // Frontiers in Allergy. 2023. Vol. 3. 1009437. DOI: 10.3389/fal-gy.2022.1009437.

18. Lymphocyte transformation test: History and current approaches / B. Sachs, A. Fatangare, A. Sickmann, A. Glassner // Journal of Immunological Methods. 2021. Vol. 493. P. 113036. DOI: 10.1016/j. jim.2021.113036.

19. Okano M. New insights into the world of eosinophils in allergic diseases // Allergology International. 2021. Vol. 70, No.1. P. 1-2. DOI: 10.1016/j.alit.2020.11.008.

20. Childhood blood eosinophils and symptoms of allergic disorders: a cross-sectional study in Southern China / X. Hou [et al.] // Annals of Medicine. 2022. Vol. 54, No. 1. P. 2929-2940. DOI: 10.1080/07853890.2022.2134584.

21. Global Burden of Allergies: Mechanisms of Development, Challenges in Diagnosis, and Treatment / E. Alska [et al.] // Life (Basel). 2025. Vol. 15, No. 6. P. 878. DOI: 10.3390/life15060878.

22. Nomenclature of allergic diseases and hypersensitivity reactions: Adapted to modern needs: An EAACI position paper / M. Jutel [et al.] // Allergy. 2023. Vol. 78, No. 11. P. 2851-2874. DOI: 10.1111/all.15889.

23. Nasal allergen provocation test: updated indications and diagnostic accuracy / D. Kanjanawasee, A. Wattanaphichet, P. Tantilipikorn, B. Tantikun // Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 2025. Vol. 25, No. 3. P. 157-168. DOI: 10.1097/ ACI.0000000000001066.

24. Allergen provocation tests in respiratory research: building on 50 years of experience / G.M. Gauvreau [et al.] // European Respiratory Journal. 2022. Vol. 60, No. 2. 2102782. DOI: 10.1183/13993003.02782-2021.

25. Organ-specific allergen challenges in airway allergy: Current utilities and future directions / J.L. Fauquert [et al.] // Allergy. 2023. Vol. 78, No. 7. P. 1794-1809. DOI: 10.1111/all.15731.

26. Will Oral Food Challenges Still Be Part of Allergy Care in 10 Years' Time? / N. Patel, W.G. Shreffler, A. Custovic, A.F. Santos // Journal of Allergy and Clinical Immunology: In Practice. 2023. Vol. 11, No. 4. P. 988-996. DOI: 10.1016/j.jaip.2023.02.010.

27. Siraganian R.P. An automated continuous-flow system for the extraction and fluorometric analysis of histamine // Analytical Biochemistry. 1974. Vol. 57, No. 2. P. 383-394. DOI: 10.1016/0003-2697(74)90093-1.

28. Mast cell activation test in chlorhexidine allergy: a proof of concept / J. Elst [et al.] // British Journal of Anaesthesia. 2020. Vol. 125, No. 6. P. 970-975. DOI: 10.1016/j.bja.2020.06.024.

29. A novel human mast cell activation test for peanut allergy / A.F. Santos [et al.] // Journal of Allergy and Clinical Immunology. 2018. Vol. 142, No. 2. P. 689-691.e9. DOI: 10.1016/j.jaci.2018.03.011.

30. Abud E.M., White A.A. Mast Cells in Aspirin-Exacerbated Respiratory Disease // Current Allergy and Asthma Reports. 2024. Vol. 24, No. 2. P. 73-80. DOI: 10.1007/s11882-024-01125-1.

31. Worrall W.P.M., Reber L.L. Current and future therapeutics targeting mast cells in disease // Pharmacology & Therapeutics. 2025. Vol. 273. P. 108892. DOI: 10.1016/j.pharmthera.2025.108892.

32. Santos A.F., Alpan O., Hoffmann H.J. Basophil activation test: Mechanisms and considerations for use in clinical trials and clinical practice // Allergy. 2021. Vol. 76, No. 8. P. 2420-2432. DOI: 10.1111/ all.14747.

Комментарии