Изучение противовирусной активности Ингавирина в отношении «сезонного» вируса гриппа А (H1N1) в культуре клеток MDCK

Г. А. ГАЛЕГОВ¹, В. Л. АНДРОНОВА¹, В. Е. НЕБОЛЬСИН²

Ингавирин^® является малотоксичным веществом для культуры клеток MDCK. Концентрация препарата 1000 мкг/мл не достигает величины ЦЦ₅₀. Антигриппозная активность Ингавирина^® изучалась в отношении вируса гриппа A (H1N1) 1—7 пассажей, включая вариант вируса, резистентный к Ремантадину^® . Установлено, что Ингавирин^® при множественности инфицирования 0,01 ЦПЦ₅₀/мл в концентрации 250—400 мкг/мл обеспечивает предотвращение развития вирусиндуцированного ЦПЭ. Аналогичные результаты были получены в отношении вируса гриппа A (H1N1), резистентного к Ремантадину^® . В таких же концентрациях препарат влияет на репродукцию вируса гриппа, что выразилось в подавлении образования гемагглютининов. В ходе многократного пассирования вируса при возрастающих концентрациях Ингавирина^® в культуре клеток MDCK резистентных к препарату мутантов получено не было. Противогриппозная активность Ингавирина^® сохраняется при его введении через 60 и даже через 90 минут после адсорбции при множественности инфицирования 0,01 ЦПЦ₅₀/мл.
Ключевые слова: вирус гриппа H1N1, прововирусная активность, Ингивирин^® .

Investigation of Ingavirin^® Antiviral Activity Against Season Influenza Virus A (H1N1) in MDCK Cell Culture

G. A. GALEGOV, V. L. ANDRONOVA, V. E. NEBOLSIN
D. I. Ivanovsky Research Institute of Virology, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow
Valenta Pharmacevtica, Moscow

Ingavirin^® is low toxic for the MDCK cell culture. The drug concentration of 1000 mcg/ml does not reach the CD₅₀ value. The antiviral activity of Ingavirin^® was studied with respect to the influenza virus A (H1N1), including the Remantadin^® resistant variant, in 1—7 subcultutes. In multiple contamination by 0.01 CPD₅₀/ml Ingavirin^® in concentrations of 250 to 400 mcg/ml prevented development of the virus-induced with respect to the Remantadin^® resistant variant of the influenza virus A (H1N1). In the same concentration the drug affected the virus reproduction, evident from inhibition of the hemagglutinin formation. No Ingavirin^® resistant mutant were isolated after the virus repeated subcultures in the presence of the increasing drug concentrations in the MDCK cell culture. In the experiment with multiple contamination by 0.01 CPD₅₀/ml, the Ingavirin^® antiviral activity was detectable when the drug was administered 60 and even 90 min after the adsorption.
Key words: influenza virus A (H1N1), Ingavirin^® , antiviral actvity.

Введение
Грипп является одной из самых распространённых в мире вирусной инфекцией, от которой ежегодно умирает до 500 тыс. человек [1]. За последние годы эпидемическая ситуация по гриппу осложняется вспышками заболевания, вызываемого вирусом гриппа A (H5N1), представляющим опасность и для людей. По данным ВОЗ, к 27 ноября 2009 года было зарегистрировано 444 случая заражения людей этим вирусом с летальностью 59% [2]. Существует опасность образования реассортантов вирусов гриппа человека и птиц, высокопатогенных для человека.

На очередном заседании ВОЗ в июне 2009 года Генеральный директор ВОЗ Маргарет Чен объявила о первой в XXI веке пандемии вируса гриппа, вызванной вирусом гриппа A H1N1/2009, которой был присвоен шестой (максимальный) уровень опасности. С момента первого выделения вируса вспышки заболевания отмечены в 179 странах мира (по состоянию на 7 декабря 2009 г.), зафиксировано 1363786 случаев заражения, из которых 108 889 — с летальным исходом. В России подтверждено 237 случаев этого опасного заболевания. По мнению экспертов, пандемия может продолжаться по всему миру в течение двух лет и более.

Создание вакцины, эффективной в отношении нового циркулирующего возбудителя, требует немалого времени. Поэтому этиотропные лекарственные препараты могут быть единственным средством предотвращения распространения вирусной инфекции. До последнего времени современный арсенал химиотерапевтических противогриппозных препаратов, разрешенных к применению в Российской Федерации, был представлен Ремантадином^® (ингибирующим функцию белка М2), Арбидолом^® (препятствующим слиянию липидной оболочки вируса с клеточными мембранами), Осельтамивиром (Тамифлю^® ) и Занамивиром (Реленза^® ) — ингибиторами нейраминидазы вируса [3, 4]. Известно, что формирование лекарственной резистентности является ограничивающим фактором для применения этиотропных лекарственных препаратов. Резистентные штаммы циркулируют в природе и представляют эпидемическую опасность [5—9]. Так, в отношении циркулирующего пандемического штамма вируса гриппа А H1N1/2009 не подтверждена фармакологическая активность Ремантадина^® , доступного и широко используемого в России препарата. В связи с этим поиск и создание новых противогриппозных препаратов, имеющих иной механизм действия и активных в отношении вариантов вируса, резистентных к действию применяемых на практике лекарственных препаратов, представляет большую практическую значимость.

В многочисленных исследованиях показана противогриппозная активность нового оригинального отечественного препарата Ингавирин^® (имидазолилэтанамид пентандиовой кислоты) в отношении вируса гриппа А (H3N2) в исследованиях in vivo [10].

Ингавирин^® прошел клиническую апробацию и с 2008 г. разрешен к применению как противогриппозный препарат [11].

Механизм действия Ингавирина^® связан со снижением эффективности конформационного созревания нуклеокапсидного белка вируса NP и ингибированием его миграции из цитоплазмы в ядро клетки [12]. Таким образом, механизм действия Ингавирина^® принципиально иной, чем у других этиотропных противогриппозных лекарственных препаратов.

Целью настоящего исследования явилось изучение эффективности Ингавирина^® в отношении вируса гриппа А Н1N1/Новая Каледония/20/99 в культуре клеток MDCK и вероятность формирования резистентных штаммов к препарату.

Материал и методы
Клетки. Культуру клеток почек собаки MDCK (Madin-Darby canine kidney cell line) выращивали в 24- и 96-луночных пластиковых планшетах с использованием ростовой среды Игла (ГУ НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов, Москва), соединённой с 5% эмбриональной телячьей сывороткой (предприятие «ПанЭко», Москва) при 37°С в атмосфере 5% СО2. Среда поддержки: среда Игла, содержащая 0,2% бычьего сывороточного альбумина (bovine albuminum fraction V solution 7,5%, Gibco) и 2 мкг/мл ТРСК-трипсина (tolylsul-fonyl phenilalanylchloromethylketone-trypsine, Sigma).

Вирус. Вирус гриппа А Н1N1/Новая Каледония/20/99 любезно предоставлен Е. И. Исаевой (лаборатория иммунологии ГУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН).

Препараты. Ингавирин^® (2-(имидазол-4-ил)этанамид пентандиовой-1,5 кислоты) производства ОАО «Валента Фармацевтика» (Российская Федерация) представляет собой низкомолекулярный пептидоамин, аналог эндогенного пептидоамина, выделенного из тканей морского моллюска Aplysia Californica.

Ремантадин^® солянокислый (α-метил-1-адамантанметиламина гидрохлорид) производства АО «Адамантан», Москва.

Оценка антивирусной активности препаратов с использованием метода ингибирования развития вирусиндуцированного цитопатического эффекта (ЦПЭ) выполнялась в соответствии с общепринятой методикой [13]. Монослойные культуры клеток MDCK (24 ч), выращенные в 24- и 96-луночных планшетах, дважды отмывали от ростовой среды физиологическим раствором. В 96-луночных планшетах готовили серийные разведения препарата и вносили вируссодержащий материал.

При использовании 24-луночных планшетов монослойную культуру клеток заражали вирусом и после часовой адсорбции вносили среду поддержки. В опыте среда поддержки содержала препараты в известной концентрации, которые вносили сразу после адсорбции, либо через 60 и 90 мин.

Множественность инфицирования клеточных культур составила от 1 до 0,001 ЦПД 50/кл. Ежедневно осуществлялся мониторинг наличия вирусиндуцированного ЦПЭ, результаты учитывались, когда в контроле вируса развивался 95—100% ЦПЭ.

Оценка антивирусной активности препаратов с использованием реакции гемагглютинации. Монослойные культуры клеток MDCK выращивали в 24-луночных пластиковых планшетах. Множественность инфицирования составила 0,01 ЦПД 50/мл. Через 72 ч монослой инфицированной культуры клеток собирали. Наличие гемагглютинирующей активности определяли с использованием эритроцитов человека 1 (0) группы в 96-луночных круглодонных планшетах. Представлены результаты двух независимых опытов.

Схема пассирования вируса с целью получения резистентного варианта. Пассирование вируса проводили в присутствии Ингавирина^® в концентрации 300 мкг/мл, являющуюся минимально активной при множественности инфицирования 0,01 ЦПД 50/мл. В первом пассаже множественность инфицирования составляла 0,1 ЦПД 50/мл. В последующих пассажах использовали множественность инфицирования в 10 раз меньшую — 0,01 ЦПД 50/мл. Определяли чувствительность к Ингавирину^® материала каждого пассажа с использованием метода ингибирования развития вирусиндуцированного ЦПЭ.

Вариант вируса, резистентного к Ремантадину^® , получали путем проведения серийного пассирования вируса в градиенте концентраций Ремантадина^® от 0,5 мкг/мл в первом пассаже до 5 мкг/мл с последующим клонированием полученной популяции. Множественность инфицирования — от 1 ЦПД 50/мл в первом пассаже до 0,01 ЦПД 50/мл в последующих пассажах. Материал четвертого пассажа был полностью резистентен к Ремантадину^® в концентрации 5 мкг/мл.

Оценка цитотоксичности Ингавирина^® проводилась с использованием метода окрашивания клеток трипановым голубым после 72 ч инкубирования клеток MDCK в присутствии известной концентрации препарата в среде поддержки. Разведения препарата готовили в 96-луночных пластиковых планшетах со сформировавшимся 24-часовым клеточным монослоем. После 72-часового инкубирования проводили окрашивание клеток трипановым голубым и вычисляли количество живых клеток в процентах к общему количеству клеток в лунке. Приведены результаты двух независимых опытов.

Результаты и обсуждение
Полученные данные показали, что препарат Ингавирин^® оказался малотоксичным для культуры клеток MDCK. Максимальная использованная в дальнейших исследованиях концентрация препарата 600 мкг/мл является нецитотоксичной: количество инактивированных клеток после 72 часов инкубирования неинфицированной клеточной культуры в присутствии препарата не достигало величины ЦД₅₀ (25,4%). Соответствующий показатель для контроля клеток, инкубированных в тех же условиях, но без препарата в среде поддержки, составлял 5,9%. В присутствии препарата в концентрации 1000 мкг/мл гибель клеток не превышала 34,6%.

При изучении влияния Ингавирина^® на развитие вирусиндуцированного ЦПЭ в культуре клеток MDCK использовали вирус гриппа А HlNl/Новая Каледония/20/99, чувствительный к Ремантадину^® , а также его вариант, резистентный к Ремантадину^® (ИД₅₀>5 мкг/мл). В табл. 1 приведены результаты изучения противогриппозной активности Ингавирина^® при его введении в экспериментальную систему непосредственно после адсорбции вируса.

Таблица 1.

Влияние Ингавирина^® на развитие вирусиндуцированного ЦПД в культуре клеток MDCK, инфицированных вирусом гриппа А (Н1N1)

Как видно из приведённых данных, при использовании множественности инфицирования 0,01 и 0,001 ЦПД₅₀/кл обнаруживается противовирусная активность Ингавирина^® . При этом Ингавирин^® при той же множественности инфицирования одинаково эффективен в отношении как ремантадиночувствительного, так и ремантадинорезистентного вариантов вируса: величины ИД₅₀ равны 250 и 250 мкг/мл соответственно. Как следует из таблицы 1, препарат в нецитотоксичной концентрации 400 мкг/мл (множественность инфицирования 0,01 и 0,001 ЦПД₅₀/кл) обеспечивал полное подавление развития вирусиндуцированного ЦПЭ (ИД₉₅).

В следующей серии экспериментов клеточные культуры, выращенные в 96-луночных пластиковых планшетах, инфицировали с множественностью 0,01 ЦПД₅₀/кл. Ингавирин^® вносился через 60 и 90 мин после адсорбции. В таких условиях противовирусная активность Ингавирина^® не снижалась: наблюдалось 50 и 95—100% ингибирование развития вирусиндуцированного ЦПЭ в тех же концентрациях (250 и 400 мкг/мл соответственно), что и при введении Ингавирина^® непосредственно после адсорбции.

Способность Ингавирина^® ингибировать репродукцию вируса гриппа А (H1N1) изучалась путем определения гемагглютинирующей активности вируссодержащего материала. Для этого культуру клеток, выращенную в 24-луночных планшетах, инфицировали (множественность инфицирования 0,01 ЦПД₅₀/кл) и инкубировали в присутствии препарата в известной концентрации. Исследовали диапазон концентраций Ингавирина^® от 125 до 500 мкг/мл. Через 72 ч, когда в контроле вируса развивался 100% ЦПЭ, определяли гемагглютинирующую активность полученного материала. Титр гемагглютинина в контроле вируса составлял 1:32. Минимальная концентрация препарата, в присутствии которой гемагглютинирующая активность вируса не обнаруживалась, составляла 400 мкг/мл.

При введении Ингавирина^® по лечебно-профилактической схеме неинфицированную клеточную культуру инкубировали в присутствии 500 мкг/мл препарата в течение 90 мин. Затем клетки инфицировали с множественностью 0,01 ЦПД₅₀/кл и инкубировали в присутствии препарата в известной концентрации. В этих условиях концентрация Ингавирина^® , в присутствии которой не обнаруживалась гемагглютинирующая активность, снижалась до 250 мкг/мл.

В следующей серии экспериментов попытались получить популяцию вируса гриппа А (H1N1), резистентную к Ингавирину^® , путем проведения серийного пассирования вируса в его присутствии, как описано выше в разделе «Материал и методы». В табл. 2 представлены результаты изучения чувствительности материала каждого пассажа к Ингавирину^® . Максимальная использованная концентрация Ингавирина^® не превышала 600 мкг/мл.

Таблица 2.

Оценка чувствительности к Ингавирину^® материала каждого пассажа вируса гриппа А HINI/Новая Каледония/20/99 в процессе пассирования в присутствии Ингавирина^® (множественность инфицирования 0,01 ЦПД₅₀/мл)

Как следует из приводимых данных (см. табл. 2), пассирование вируса гриппа A/HINI/Новая Каледония/20/99 в присутствии 300 мкг/мл Ингавирина^® (7 пассажей) не привело к снижению чувствительности вируса к высоким концентрациям препарата (см. табл. 1). Выявляемая активность препарата соответствует полученным ранее данным об антивирусной активности Ингавирина^® на этой вирусной модели. К Ремантадину^® формируется резистентность (снижение чувствительности) уже после четвертого пассажа вируса гриппа А в культуре клеток MDCK. С таким вариантом вируса проводились исследования, представленные в табл. 1.

Таким образом, результаты исследования in vitro свидетельствуют о высокой эффективности Ингавирина^® в отношении изучаемого штамма вируса гриппа А/Н1N1/Новая Каледония/20/99 1—7 пассажей, в том числе ремантадиноустойчивого варианта вируса.

ЛИТЕРАТУРА

1. Гендон Ю. 3. Вакцины и химиопрепараты для профилактики гриппа. Вопр вирусол 2007; 1: 4—10.
2. 090725_1700hrs.pdf.
3. Галегов Г. А., Андронова В. Л. Химиотерапия вирусных инфекций / Львов Д.К, ред. Медицинская вирусология. Руководство. М.: 2008; 87—92.
4. Gubareva L. V., Kaiser L, Hayden F. G. Influenza virus neuraminidase inhibitors. Lancet 2000; 355: 627—835.
5. Иванова В. Т., Курочкина Я. Е., Бурцева Е. И. и др. Распространение и биологические свойства эпидемических штаммов вирусов гриппа А и В, циркулирующих в сезоне 2006—2007 гг. в России. Вопр вирусол 2008; 5: 19—23.
6. Bright R. A., Medina M. J., Xu X. et al. Incidence of amantadine resistance among influenza A (H3N2) viruses isolated worldwide from 1994—2005: a cause for concern. Lancet 2005; 366: 1175—1181.
7. Bright R. A., Shay D. K, Shay B. et al. Adamantane resistance among influenza A viruses isolated early during the 2005—2006 influenza season in the United States. JAMA 2006; 295: 8: 891—894.
8. Lacenby A., Hungnes O., Dudmam S. G. et al. Emergence of resistance to oseltamivir among influenza A(H1N1) viruses in Europe. Eurosurveillance 2008; 13: Issue 5: 8026.
9. Leneva I., Hay. The mechanism of action of arbidol against influenza virus — selection and characterization of arbidol-resistant mutants. 12th International Congress of Virology. Paris, 2002; 1077: Abstr.
10. Логинова С. Я., Борисевич С. В., Максимов В. А. и др. Изучение лечебной эффективности нового отечественного препарата Ингавирин^® в отношении возбудителя гриппа A (H3N2). Антибиотики и химиотер 2008; 53: 7—8: 27—30.
11. Колобухина Л. В., Малышев Н. А., Меркулова Л. Н. и др. Изучение эффективности и безопасности нового противовирусного препарата Ингавирин при лечении больных гриппом. Русс мед журн 2008; 16: 23: 1—5.
12. Небольсин В. Е., Новиков Ф. Н., Семенова Н. П. и др. Поиск терапевтических мишеней и исследование механизма противогриппозной активности нового препарата Ингавирин^® . Мат. тез. докл. IV Российского научного симпозиума «Белки и пептиды», 23—27 июня 2009г. г. Казань. Казань, 2009; 103.
13. Kaverin N. V., Webster R. G. Impairment of multicycle influenza virus growth in Ver (WHO) cells by loss of trypsin activity. J Virol 1995; 69: 4: 2700—2703.

Комментарии