Изучение эффективности Ингавирина in vitro в отношении штаммов пандемического вируса гриппа А(H1N1/09)v

Комментарии Опубликовано в журнале:
«АНТИБИОТИКИ И ХИМИОТЕРАПИЯ»; № 54; 2009; стр. 9-10.

Л. Н. ШИШКИНА1, В. Е. НЕБОЛЬСИН2, А. С. КАБАНОВ1, М. О. СКАРНОВИЧ1, У. Б. ЭРДЫНЕЕВА1, Н. А. МАЗУРКОВА1, О. А. СЕРОВА1, Е. А. СТАВСКИЙ1, И. Г. ДРОЗДОВ1

1 ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, п. Кольцово, Новосибирская обл.
2 ОАО «Валента Фарм», Москва

Ингавирин® эффективно ингибирует размножение штаммов вируса гриппа A/California/04/2009 (H1N1)v, A/California/07/2009 (H1N1)v, A/Moscow/225/2009 (H1N1)v, A/Moscow/226/2009 (H1N1)v, а также штаммов A/Chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) и A/Aichi/2/68 (H3N2) в культуре клеток MDCK. При внесении Ингавирина® in vitro снижается гемагглютинирующая и цитопатическая активность этих штаммов вируса гриппа.
Ключевые слова: вирус гриппа A(H1N1/09)v, Ингавирин® , противовирусная активность.

In vitro Efficacy of Ingavirin® against the Pandemic Influenza Virus A(H1N1/09)v

L. N. SHISHKINA, V. E. NEBOLSIN, A. S. KABANOV, M. O. SKARNOVICH, U. B. ERDYNEEVA, N. A. MAZURKOVA, O. A. SEROVA, E. A. STAVSKY, I. G. DROZDOV
State Research Centre of Virology and Biotechnology VECTOR, Koltsovo, Novosibirsk Region
JSC Valenta Pharm, Moscow

Ingavirin® was shown to be efficient in inhibition of the influenza virus strains A/California/04/2009 (H1N1)v, A/California/07/2009 (H1N1)v, A/Moscow/225/2009 (H1N1)v and A/Moscow/226/2009 (H1N1)v, as well as the strains A/Chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) and A/Aichi/2/68 (H3N2) in the MDCK cell culture. The hemagglutinin and cytopathic activity of the influenza virus strains decreased at entering Ingavirin® in vitro.
Key words: influenza virus A(H1N1/09)v, Ingavirin® , antiviral activity.

В лаборатории Центра контроля за инфекционными заболеваниями (CDC, США) 15 апреля 2009 года у 10-летнего ребенка с клиническими признаками респираторного заболевания (лихорадка, кашель, рвота) был выделен новый вариант вируса гриппа А субтипа H1N1 [1]. Было показано, что новый вариант возник в результате реассортации в геноме штаммов вируса гриппа свиней Евроазиатской линии и штаммов вируса гриппа свиней Североамериканской линии, которая возникла в конце 1990-х после тройной реассортации субтипов H1N1, H3N2 и H1N2 внутри классических свиных штаммов [2].

По данным ВОЗ, к началу ноября 2009 г. было зарегистрировано более 400000 лабораторно подтверждённых случаев заболевания пандемическим гриппом H1N1/09, из которых свыше 4740 случаев закончились смертельным исходом [3]. В январе-феврале 2010 г. активность пандемического гриппа H1N1/2009 в странах Европейского региона сохранялась, несмотря на тенденцию к снижению. Наиболее высокой она оставалась в таких странах, как Грузия, Польша, Сербия и Украина, а также в отдельных регионах РФ. При этом всего с апреля 2009 г. в Европе сообщалось о 4057 случаях смерти, связанных с лабораторно подтверждённым инфицированием вирусом пандемического гриппа A(H1N1/09) [4]. Международный опыт в области лечения пандемического гриппа H1N1/09 показывает, что плохие клинические результаты связаны с поздним обращением за медицинской помощью и задержкой начала противовирусной терапии [3, 5].

Наряду с пандемией гриппа A(H1N1/09) в январе 2010 г. появились сообщения о случаях заболевания, связанных с инфицированием вирусом гриппа птиц в Египте. Они подтверждены Центральными лабораториями общественного здравоохранения Египта, Национальным центром по гриппу в рамках Глобальной сети ВОЗ по эпиднадзору за гриппом (GISN) [6]. Из 97 лабораторно подтверждённых случаев заболевания птичьим гриппом A(H5N1), зарегистрированных в Египте, 27 закончились смертельным исходом. Во всех случаях имелся контакт с больными и мёртвыми домашними птицами [6].

Существует четыре противовирусных препарата, которые рекомендованы ВОЗ для лечения гриппа: амантадин и римантадин (ингибиторы вирусного белка М2), осельтамивир и занамивир (ингибиторы вирусной нейраминидазы). Недавние исследования показали, что вирус гриппа A(H1N1/09)v, который был выявлен у людей, устойчив к амантадину и римантадину, в то же время этот вирус восприимчив к осельтамивиру и занамивиру [7].

В связи с ежегодными эпидемиями гриппа, возможностью заражения людей вирусом гриппа животного происхождения и возникновением пандемии гриппа среди людей, остро встаёт вопрос о создании надёжных средств для его профилактики и лечения.

Целью настоящего исследования является изучение эффективности отечественного препарата Ингавирин® in vitro в отношении штаммов пандемического вируса гриппа A(H1N1) 2009 г., а также штаммов вируса гриппа A(H5N1) и A(H3N2).

Материал и методы
Вирус. В работе использовали следующие штаммы вируса гриппа (ВГ): A/California/04/2009 (H1N1)v и A/California/07/2009 (H1N1)v, полученные в мае 2009 г. из CDC (США); A/Moscow/225/2009 (H1N1)v и A/Moscow/226/2009 (H1N1)v, выделенные и охарактеризованные в ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» в июне 2009 г.; A/Chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) и A/Aichi/2/68 (H3N2), полученные из «Коллекции микроорганизмов» ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор». Штаммы A/California/07/2009 (H1N1)v, A/Moscow/226/2009 (H1N1)v, A/Chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) и A/Aichi/2/68 (H3N2) были наработаны на развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ), штаммы A/California/04/2009 (H1N1)v и A/Moscow/225/2009 (H1N1)v были наработаны в культуре клеток MDCK. Концентрацию вируса в исследуемых образцах определяли путём титрования на РКЭ или клетках MDCK [8], рассчитывали и выражали в lgЭИД50/мл (десятичных логарифмах 50% эмбриональных инфицирующих доз в мл) или в lgТЦД50/мл (десятичных логарифмах 50% тканевых цитопатических доз в мл) по методу Спирмана-Кербера [9]. Наработанные и использованные в работе серии вирусосодержащей аллантоисной жидкости ВAЖ) и культуральной жидкости со штаммами вируса гриппа хранили при -70°С.

Клеточная культура. Для тестирования противовирусной активности препаратов использовали перевиваемую культуру клеток MDCK (клетки почки собаки). По 100 мкл суспензии клеток MDCK с концентрацией 1,0—1,5х105 кл/мл вносили в лунки 96-луночных планшетов. Планшеты с клетками помещали в термостат при температуре 37°C, 5% СО2 и 100% влажности на 1—2 сут до образования сплошного клеточного монослоя.

Исследуемые препараты. В работе использован Ингавирин® производства OAO «Валента Фарм» (Россия) и Ремантадин® (ООО «Розфарм», Россия). При проведении исследования препараты вносили в культуральную среду через 1 час после адсорбции вируса на клетках в следующих конечных концентрациях в среде культивирования: Ингавирин® — 200 мкг/мл, Ремантадин® — 10 мкг/мл.

Инфицирование клеток MDCK вирусом гриппа. Готовили разведения исходных образцов вируса гриппа с 1-го по 7-е с десятикратным шагом с использованием среды MDCK StemAlpha (Франция), содержащей 2 мкг/мл трипсина TPCK (Sigma, СШA). По 50 мкл разведений вируса вносили в лунки с монослоем клеток MDCK (по 6 лунок на каждое разведение). Aдсорбцию вируса проводили в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем в каждую лунку с инфицированными клетками MDCK вносили исследуемые препараты в объёме 50 мкл и по 50 мкл питательной среды MDCK StemAlpha с 2 мкг/мл трипсина TPCK.

В контрольные лунки с инфицированными клетками вносили по 100 мкл питательной среды MDCK StemAlpha с 2 мкг/мл трипсина TPCK. Клетки инкубировали 4 сут при температуре 37°C в атмосфере 5% СО 2 в термостате ТС-1/80 СПУ (Россия).

Через 4 сут в каждой лунке регистрировали ЦПД в монослое клеток с помощью инвертированного микроскопа и наличие вируса в среде культивирования по реакции гемагглютинации (РГА) с 0,5% эритроцитами кур. На основании этого определяли титры вируса в lgТЦД50/мл в контроле (ИД 50 in vitro без препарата) и в опыте (ИД 50 in vitro с препаратом) и высчитывали индекс нейтрализации (ИН) вируса под влиянием препарата: ИН = ИД50контроль — НД50опыт (lg).

Далее определяли, могут ли препараты оказывать влияние на репродукцию и инфекционную активность вируса гриппа. С этой целью собирали культуральную жидкость из одного или двух рядов лунок с клетками, инфицированными одним или двумя наибольшими разведениями вируса, т. е. его наименьшими дозами, при которых вирус был зарегистрирован по РГА в ≤100% лунок в контроле и в опыте ( в присутствии и без препарата). После этого оценивали продукцию вируса в объединённых пробах из лунок каждого ряда по гемагглютинирующей (титр в РГА) и инфекционной (титр в lg ТЦД 50/мл) активности, а также рассчитывали индекс подавления его продукции под влиянием препарата in vitro на основании разницы между титрами вируса в контрольных и опытных лунках.

Оценка противовирусной эффективности препаратов осуществлялась в соответствии с рекомендациями Фармакологического государственного комитета РФ [10]. Между контрольными и опытными образцами инфицированных клеток MDCK оценивали достоверность различий (P=0,05) по ИД 50 штаммов вируса гриппа in vitro и по показателям репродукции вируса гриппа.

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку данных проводили общепринятыми методами для биологических исследований [9] с помощью метода Спирмана-Кербера с оценкой достоверности отличий (P=0,05) для 95% доверительного уровня (I 95).

Результаты и обсуждение
При внесении Ингавирина® в клеточную культуру MDCK, инфицированную штаммами вируса гриппа, было показано, что инфекционность всех исследованных штаммов под его влиянием достоверно уменьшалась (табл. 1). Наблюдаемый диапазон индексов нейтрализации исследованных штаммов находился в пределах от 0,5 до 1,7. При этом наиболее высокий индекс нейтрализации достигался при инкубировании Ингавирина® со штаммом вируса гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2) (табл. 1).

Таблица 1.

Инфекционность (50% инфицирующая доза — ИД50 в клетках MDCK) штаммов вируса гриппа A(H1N1)v in vitro в контроле и при инкубировании с Ингавирином® через 4 сут после заражения

Штаммы вируса гриппа ИД50 штамма in vitro в контроле (в lgТЦД50/мл, ± I95) ИД50 штамма in vitro при инкубировании с Ингавирином® (в lgТЦД50/мл,±I95) Индекс нейтрализации (в lg)
A/California/04/2009 (H1N1)v4,3±0,43,8±0,0*0,5*
A/California/07/2009 (H1N1)v5,0±0,53,8±0,5*1,2*
A/Moscow/225/09 (H1N1)v5,6±0,35,1±0,4*0,5*
A/Moscow/226/09 (H1N1)v5,8±0,65,1±0,4*0,7*
A/Chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) 7,3±0,7 6,1±0,4*1,2*
A/Aichi/2/68 (H3N2)7,6±0,75,9±0,3*1,7*
Примечание. * — отличия от контроля по ИД50 при р=0,05.

После оценки ИН на основании результатов РГА определяли продукцию каждого штамма вируса гриппа в лунках с клетками, инфицированными наиболее низкими дозами вируса, при которых наблюдалась РГА в ≤100% лунок. Было обнаружено, что при инкубировании инфицированных клеток MDCK с Ингавирином® продукция исследованных штаммов вируса гриппа достоверно уменьшалась и по показателям их титров в РГА и по показателям их инфекционности при титровании на клетках MDCK (табл. 2). Как следует из таблицы 2, индексы подавления продукции штаммов вируса гриппа под влиянием Ингавирина® in vitro колебались в диапазоне от 0,7 до 3,2 lg. При этом наиболее высокое значение индекса подавления продукции вируса in vitro наблюдалось при инкубировании Ингавирина® со штаммом вируса гриппа A/Chicken/Kurgan/ 05/2005 (H5N1) (табл. 2).

Таблица 2.

Показатели репродукции (титры) штаммов вируса гриппа А(H1N1)v в клетках MDCK в контроле и при инкубировании с Ингавирином® через 4 сут после заражения

Штаммы вируса гриппа Доза заражения штамма вируса гриппа в lgТЦД50 /50 мкл Репродукция штаммов вируса гриппа in vitro в контроле Репродукция штаммов вируса гриппа in vitro при инкубировании с Ингавирином®

Индекс подавления продукции вируса in vitro (в lg)

Титры в РГА

Титры в lgТЦД50/мл, ±I95

Титры в РГА Титры в lgТЦД50/мл, ±I95
A/California/04/2009 (H1N1)v 2,0 1:32 4,0±0,6 1:16 1,5±0,0* 2,5
1,01:32 4,0±0,6 1:8*1,5±0,0*2,5
A/California/07/2009 (H1N1)v1,71:512 7,5±0,0 1:2566,5±0,8*1,0
0,71:256 6,5±0,0 1:64*5,3±0,8*1,2
A/Moscow/225/09 (H1N1)v1,31:32 2,5±0,0 1:322,5±0,00,0
0,31:32 2,5±0,0 1:161,5±0,0*1,0
A/Moscow/226/09 (H1N1)v2,51:16 3,0±0,6 1:162,3±0,5*0,7
1,51:16 2,5±0,0 1:4*1,8±0,5*0,7
A/Chicken/Kurgan/ 05/2005 (H5N1)2,01:256 6,0±0,6 1:64*2,8±0,5*3,2
1,01:256 6,0±0,6 1:64*2,8±0,5*3,2
A/Aichi/2/68 (H3N2)2,31:256 5,5±0,0 1:32*2,8±0,5*2,7
1,31:256 5,0±0,6 1:16*2,8±0,5*2,2
Примечание. * — отличия от контроля при р=0,05.

Показано, что при внесении Ремантадина® в клеточную культуру MDCK, инфицированную штаммами вируса гриппа, достоверно уменьшалась инфекционность только двух исследованных штаммов: A/Chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) и A/Aichi/2/68 (H3N2) при достижении соответствующих индексов нейтрализации 2,2 и 2,0 (табл. 3). Как следует из таблицы 3, штаммы вируса гриппа A/California/04/2009 (H1N1)v, A/California/07/ 2009 (H1N1)v, A/Moscow/225/09 (H1N1)v и A/Moscow/226/09 (H1N1)v не изменяли своей инфекционности в клеточной культуре MDCK при инкубировании с Ремантадином® .

Таблица 3.

Инфекционность (50% инфицирующая доза — ИД50 в клетках MDCK) штаммов вируса гриппа А(H1N1) in vitro в контроле и при инкубировании с Ремантадином® через 4 сут после заражения

Штаммы вируса гриппа ИД50 штамма in vitro в контроле (в lgТЦД50/мл, ±I95) ИД50 штамма in vitro при инкубировании с Ремантадином® (в lgТЦД50/мл, ±I95) Индекс нейтрализации (в lg)
A/California/04/2009 (H1N1)v4,3±0,44,1±0,40,2
A/California/07/2009 (H1N1)v5,0±0,55,0±0,50,0
A/Moscow/225/09 (H1N1)v5,6±0,35,6±0,30,0
A/Moscow/226/09 (H1N1)v5,8±0,65,8±0,50,0
A/Chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) 7,3±0,7 5,1±0,4*2,2*
A/Aichi/2/68 (H3N2)7,6±0,75,6±0,7*2,0*
Примечание. * — отличия от контроля по ИД50 при р=0,05.

Определение продукции вируса гриппа в лунках с клетками, инфицированными наиболее низкими дозами штаммов вируса гриппа, при которых наблюдалась РГА в ≤100% лунок в контроле и в опыте, также показало отсутствие чувствительности к Ремантадину® штаммов вируса гриппа A(H1N1)v (табл. 4). Так, для штаммов вируса гриппа A/California/04/2009 (H1N1)v, A/California/07/2009 (H1N1)v, A/Moscow/225/09 (H1N1)v и A/Moscow/226/09 (H1N1)v не было обнаружено снижения продукции при инкубировании инфицированных клеток MDCK с Ремантадином® ни по титрам объединенных проб в РГА, ни по их инфекционности в культуре клеток MDCK (табл. 4). При этом наработка штаммов вируса гриппа A/Chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) и A/Aichi/2/68 (H3N2) достоверно снижалась под воздействием Ремантадина® (табл. 4). Как видно из табл. 4, при инкубировании инфицированных клеток MDCK с Ремантадином® индексы подавления продукции штамма A/Chicken/Kurgan/ 05/2005 (H5N1) достигали значений 1,5 и 1,7 lg при соответствующих дозах заражения 3,0 и 2,0 lg ТЦД50/50 мкл, а индексы подавления продукции штамма A/Aichi/2/68 (H3N2) были равны 1,2 и 0,9 lg при дозах заражения 2,3 и 1,3 lg ТЦД50/50 мкл соответственно.

Таблица 4.

Показатели репродукции (титры) штаммов вируса гриппа A(H1N1)v в клетках MDCK в контроле и при инкубировании с Ремантадином® через 4 сут после заражения

Штаммы вируса гриппа Доза заражения штамма вируса гриппа в lgТЦД50 50 мкл

Репродукция штаммов вируса гриппа in vitro в контроле

Репродукция штаммов вируса гриппа in vitro при инкубировании с Ремантадином® Индекс подавления продукции вируса in vitro (в lg)
Титры в РГА

Титры в lgТЦД50/мл, ±I95

Титры в РГА Титры в lgТЦД50/мл, ±I95
A/California/04/2009 (H1N1)v2,01:324,0±0,61:324,0±0,60,0
1,01:324,0±0,61:323,8±0,50,2
A/California/07/2009 (H1N1)v1,71:5127,5±0,01:5127,5±0,00,0
0,71:2566,5±0,01:2566,5±0,00,0
A/Moscow/225/09 (H1N1)v1,31:322,5±0,01:322,5±0,00,0
0,31:322,0±0,61:322,0±0,60,0
A/Moscow/226/09 (H1N1)v2,51:163,0±0,61:163,0±0,60,0
1,51:162,5±0,01:162,3±0,50,2
A/Chicken/Kurgan/ 05/2005 (H5N1)3,01:2566,3±0,51:64*4,8±0,5*1,5
2,01:2566,0±0,61:32*4,3±0,5*1,7
A/Aichi/2/68 (H3N2)2,31:2565,5±0,01:64*4,3±0,5*1,2
1,31:2565,0±0,61:32*4,1±0,4*0,9
Примечание. * — отличия от Контроля при р=0,05.

Полученные нами данные согласуются с ранее описанными результатами изучения противовирусной активности Ингавирина® [11]. Так, авторами было обнаружено подавление гемагглютинирующей активности штаммов A/California/04/2009 (H1N1)v и A/California/07/ 2009 (H1N1)v под влиянием Ингавирина® . Причем показатель эффективности Ингавирина® по подавлению гемагглютинирующей активности этих штаммов был сопоставим с таковым в отношении штамма вируса гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2). Изучение эффективности Ингавирина® в культуре клеток MDCK по подавлению цитопатической активности штаммов вируса гриппа A/California/04/2009 (H1N1)v и A/California/07/ 2009 (H1N1)v также свидетельствовало о том, что Ингавирин® эффективно ингибировал размножение вируса in vitro. При этом эффективность Ингавирина® в культуре клеток MDCK в отношении подтипов вируса гриппа A(H1N1) по подавлению цитопатической активности была сопоставима с таковыми показателями в отношении штаммов вируса гриппа A/Chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) и A/Aichi/2/68 (H3N2) [11].

Подавление гемагглютинирующей и цитопатической активности вируса гриппа А под влиянием Ингавирина® в экспериментах in vitro может осуществляться благодаря противовирусному механизму действия препарата, который основан на подавлении репродукции вируса гриппа на этапе ядерной фазы, задержке миграции нового синтезированного нуклеопротеида вируса из цитоплазмы в ядро [12, 13].

Заключение
Таким образом, при изучении влияния Ингавирина® и Ремантадина® в культуре клеток MDCK на показатели гемагглютинирующей и цитопатической активности штаммов вируса гриппа A(H1N1/09)v была показана эффективность Ингавирина® и отсутствие эффективности Ремантадина® в отношении этих штаммов. В то же время Ингавирин® и Ремантадин® проявляли противовирусную эффективность в отношении используемых в работе референс-штаммов вируса гриппа A(H5N1) и A(H3N2).

ЛИТЕРАТУРА

1. Dawood F. S, Jain S, Finelli L. et al. Emergence of a novel swine-origin influenza A (H1N1) virus in humans. Novel Swine-Origin Influenza A (H1N1) Virus Investigation Team. New Engl J Med 2009; 360: 2605-2615.
2. Zimmer S. M, Burke D. S. Historical perspective — emergence of influenza A (H1N1) viruses. N Engl J Med 2009; 361: 279—285.
3. Пандемия гриппа (H1N1) — 2009: обзор ситуации в Европейском регионе ВОЗ.
4. Снижение уровня пандемического гриппа в Европе 01—07 февраля 2010.
5. Пандемический грипп (H1N1) — 2009, Украина.
6. Птичий грипп — ситуация в Египте — обновлённая информация 29.
7. WHO Guidelines for Pharmacological Management of Pandemic (H1N1) 2009 Influenza and Other Influenza Viruses. 20 August 2009.
8. Вирусология. Методы. Пер. с англ. Мейхи Б. М.: 1988; 344.
9. Закс Л.Статистическое оценивание. М.: 1976; 598.
10. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. Хабриева Р. У. М.: 2005; 832.
11. Логинова С. Я., Борисевич С. В., Лыков М. В. и др. Изучение эффективности Ингавирина® in vitro в отношении «мексиканского» пандемического подтипа H1N1 вируса гриппа А, штаммы A/California/04/2009 и A/California/07/2009. Антибиотики и химиотер 2009; 54: 3—4: 15—17.
12. Небольсин В. Е, Новиков Ф. Н, Строганов О. Л. и др. Поиск терапевтических мишеней и исследование механизма противогриппозной активности нового препарата Ингавирин. Тезисы докладов IV Российского симпозиума «Белки и пептиды», Казань, 23—27 июня 2009; 103.
13. Семенова Н. П., Прокудина Е. Н, Львов Д. К., Небольсин В. Е. Влияние противовирусного препарата Ингавирин® на внутриклеточные преобразования и импорт в ядро нуклеокапсидного белка (NP) вируса гриппа. Вопр вирусол 2010 (в печати).

1 октября 2011 г.
Комментарии (видны только специалистам, верифицированным редакцией МЕДИ РУ)
Если Вы медицинский специалист, войдите или зарегистрируйтесь
Связанные темы:

МЕДИ РУ в: МЕДИ РУ на YouTube МЕДИ РУ в Twitter МЕДИ РУ на FaceBook МЕДИ РУ вКонтакте Яндекс.Метрика