Изучение противовирусной активности Ингавирина в отношении возбудителя гриппа А (H3N2) in vitro
Статьи Опубликовано в журнале:«АНТИБИОТИКИ И ХИМИОТЕРАПИЯ»; № 54; 2009; стр. 9-10.
С. Я. ЛОГИНОВА, С. В. БОРИСЕВИЧ, И. В. СЕМЕНОВА, В. А. МАКСИМОВ, В. П. БОНДАРЕВ, В. Е. НЕБОЛЬСИН1
Филиал федерального государственного учреждения «48 Центральный научно-исследовательский институт Министерства обороны Российской Федерации» — «Вирусологический центр», Сергиев Посад;
Проведённый сравнительный анализ эффективности Ингавирина® и этиотропных химиопрепаратов (Арбидол® и Ремантадин® ) в отношении вируса гриппа A (H3N2) в чувствительных постоянных культурах клеток свидетельствует о том, что исследуемый препарат в изученных концентрациях эффективно подавляет цитопатическую активность вируса, формирование специфического гемагглютинина и репродукцию вируса (по накоплению).
Ключевые слова: грипп А, Ингавирин® , противовирусная эффективность, культура клеток.
Investigation of in vitro Activity of Ingavirin® Against Influenza Virus A (H3N2)
S. YA. LOGINOVA, S. V. BORISEVICH, I. V. SEMENOVA, V. A. MAKSIMOV, V. P. BONDAREV, V. E. NEBOLSIN
Virological Centre of the Central Research Institute No. 48 of the Ministry of Defense of the Russian Federation, Sergiev Posad Valenta Pharmacevtica, Moscow
The comparative analysis of the efficacy of Ingavirin® and etiotropic chemotherapeuticals, such as Arbidol® and Remantadin® , against the influenza virus A (H3N2) performed with the use of susceptible permanent cell cultures showed that in the used concentrations Ingavirin was efficient in inhibition of the virus cytopathic activity , formation of the specific hemagglutinin and reproduction of the virus (by the accumulation).
Key words: influenza virus A, Ingavirin® , antiviral efficacy, cell culture.
Одним из первых этапов доклинического исследования новых лекарственных противовирусных препаратов является оценка их активности в чувствительных культурах клеток в отношении вируса гриппа. В связи с тем, что различные типы и линии клеток обладают разной чувствительностью к воздействию противовирусных препаратов, оценку их эффективности нередко проводят с использованием нескольких типов и линий клеток [1]. Использование нескольких культур клеток позволяет более достоверно осуществлять оценку активности существующих и новых лекарственных соединений.
Целью наших исследований являлось изучение эффективности нового отечественного химиопрепарата Ингавирин® в отношении экспериментальной гриппозной инфекции in vitro.
Материал и методы
Вирус. В работе использовали адаптированный к лёгким белых мышей вирус гриппа, штамм A/Aichi/2/68 (H3N2), полученный из ГУ «НИИ вирусологии» им. Д. И. Ивановского РАМН. Штамм A/Aichi/2/68 вируса гриппа, подтип H3N2, является прототипным по отношению к основным подтипам, циркулирующим в настоящее время (H3N2 и H1N1). Он широко используется отечественными и зарубежными специалистами при оценке защитной эффективности лекарственных средств (химиопрепаратов, интерферона и его индукторов) и медицинских иммунобиологических препаратов (вакцин, иммуноглобулинов).
Штамм хранится в Специализированной коллекции Филиала ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России — ВЦ».
Культуры клеток. Использованы постоянные культуры клеток почек зеленых мартышек — GMK-AH-1(Д), почек свиньи — СПЭВ и почек собаки — MDCK. В качестве ростовой среды и среды поддержания использовали полусинтетическую среду (ПС-4) на растворе Хенкса, содержащую 7,5 и 2% сыворотки крупного рогатого скота соответственно.
Исследуемые препараты. Ингавирин® — производства ОАО «Валента Фармацевтика», Россия; Арбидол® — производства ЗАО «Мастерлек», Россия; Ремантадин® — производства ООО «РОЗФАРМ», Россия. В исследованиях использовались коммерческие препараты с гарантированным производителем сроком годности.
Противовирусную эффективность препаратов in vitro оценивали по следующим показателям:
— снижение уровня накопления вируса под воздействием препарата (Δ, lg);
— коэффициент ингибирования (Ки), %;
— подавление цитотоксической активности вируса, %.
Уменьшение уровня накопления вируса под влиянием препарата (Δ, lg) определяли по формуле:
Δ = Ак- Ао, (1);
где Ак — уровень накопления вируса при культивировании без внесения в питательную среду изучаемого препарата (lg ЦПД50/МЛ); Ао — уровень накопления вируса при культивировании с внесением в питательную среду изучаемого препарата (lg ЦПД50/мл).
Коэффициент ингибирования (Ки, %) рассчитывали по формуле:
Ku = (Аконтр - Аоп)/Аконтр X 100% (2);
где Аконтр — уровень накопления вируса при культивировании без внесения в питательную среду изучаемого препарата, (ЦПД50/мл); Аоп — уровень накопления вируса при культивировании с внесением в питательную среду изучаемого препарата (ЦПД50/мл).
Оценка противовирусной эффективности используемых лекарственных препаратов осуществлена в соответствии с требованиями Фармакологического государственного комитета РФ [1]. Статистическую обработку экспериментальных данных проводили по Стьюденту [2]
Результаты и обсуждение
Исследования препаратов проводили по нескольким направлениям: изучение подавления цитотоксичности вируса, формирования специфичного гемагглютинина и репродукции вируса в монослое культуры клеток.
Результаты оценки токсичности Ингавирина® для постоянных культур клеток GМК-АН-1(Д), СПЭВ и MDCK свидетельствуют, что в концентрациях от 20 до 1000 мкг/мл препарат не вызывает визуально наблюдаемых изменений во всех использованных культурах клеток [3].
В работе использовали максимально эффективные дозы Ремантадина® и Арбидола® (1/2 от максимально переносимой концентрации), составляющие 50 и 25 мкг/мл соответственно. Более высокие их концентрации токсичны для исследуемых культур клеток, а более низкие менее эффективно ингибируют репродукцию вируса гриппа [3]. В то же время Ингавирин® использовали в концентрации 200 мкг/мл, составляющей 1/5 от максимально переносимой концентрации.
При изучении влияния препаратов на цитотоксическую активность вируса в культурах клеток MDCK, GМК-АН-1(Д) и СПЭВ (табл. 1) было установлено, что Ингавирин® в концентрации 200 мкг/мл подавляет способность вируса гриппа, штамм A/Aichi/2/68 (H3N2), вызывать цитопатический эффект в монослое культур клеток (через 72 ч после инфицирования) на 64—70%. Изучение влияния Ингавирина® на динамику (через 12, 24, 48, 72 ч после инфицирования) репродукции вируса в культурах клеток свидетельствует о том, что в первые двое суток после инфицирования препарат полностью ингибирует цитопатическую активность возбудителя и формирование специфического гемагглютинина.
Таблица 1.
Сравнительная эффективность Ингавирина® по подавлению цитопатической активности вируса гриппа, штамм A/Aichi/2/68 (H3N2), в постоянных культурах клеток
| Препарат | Концентрация препарата, мкг/мл | Культура клеток | Коэффициент подавления ЦПД, % (Хср.±σхср) |
| Ингавирин® | 200 | GMK-АН-1(Д) | 66,7±3,3 |
| 100 | 50,0±0,0 | ||
| Арбидол® | 25,0 | 33,3±3,3 | |
| Ремантадин® | 50,0 | 80,0±5,7 | |
| Ингавирин® | 200 | MDCK | 64,0±1,3 |
| 100 | 58,0±3,3 | ||
| Арбидол® | 25,0 | 40,0±3,1 | |
| Ремантадин® | 50,0 | 86,0±2,4 | |
| Ингавирин® | 200 | СПЭВ | 70,0±0,0 |
| 100 | 60,0±5,8 | ||
| Арбидол® | 25,0 | 36,7±3,3 | |
| Ремантадин® | 50,0 | 83,3±3,3 |
Наименее эффективно подавляет цитотоксическую активность вируса Арбидол® , коэффициент ингибирования — 33—40%.
Результаты исследования по выявлению специфического гемагглютинина в поддерживающей среде культур клеток GМК-АН-1(Д), MDCK и СПЭВ (табл. 2) в присутствии лекарственных препаратов свидетельствуют о том, что Ингавирин® подавляет формирование гемагглютинина (через 72 ч после инфицирования) соответственно на 87,5, 85,0 и 87,5%; Ремантадин® — на 97,9, 96,9 и 96,7%; Арбидол® — на 33,3, 50,0 и 58,3%.
Таблица 2.
Сравнительная эффективность Ингавирина® по подавлению образования специфического гемагглютинина вируса гриппа, штамм A/Aichi/2/68 (H3N2), в постоянных культурах клеток
| Препарат | Концентрация препарата, мкг/мл | Культура клеток | Коэффициент подавления ЦПД, % (Хср.±σхср.) |
| Ингавирин® | 200,0 | GMK-AH-1(Д) | 87,5±0,0 |
| 100,0 | 75,0±0,0 | ||
| Арбидол® | 25,0 | 33,3±16,7 | |
| Ремантадин® | 50,0 | 97,9±2,1 | |
| Ингавирин® | 200,0 | MDCK | 85,0±1,3 |
| 100,0 | 80,0±1,1 | ||
| Арбидол® | 25,0 | 50,0±0,0 | |
| Ремантадин® | 50,0 | 96,9±0,0 | |
| Ингавирин® | 200,0 | СПЭВ | 87,5±0,0 |
| 100,0 | 75,0±0,0 | ||
| Арбидол® | 25,0 | 58,3±8,3 | |
| Ремантадин® | 50,0 | 96,7±0,0 |
Исследования по изучению подавления репродукции вируса в культурах клеток MDCK и GMK-AH-1(Д) исследуемыми препаратами выявили, что препарат Ингавирин® эффективно подавляет репродукцию вируса гриппа, штамм A/Aichi/2/68 (H3N2), в культурах клеток через 72 ч после инфицирования. Референс-препарат Ремантадин® также эффективно подавляет репродукцию вируса in vitro, в отличие от препарата Арбидол® (табл. 3). Учитывая результаты изучения цитотоксичности Ингавирина® и противовирусной эффективности можно сделать вывод о том, что величина ХТИ (химиотерапевтический индекс) для этого препарата более 10.
Таблица 3.
Сравнительная эффективность Ингавирина® в отношении вируса гриппа, штамм A/Aichi/2/68 (H3N2), по подавлению репродукции вируса в постоянных культурах клеток (n=3)
| Препарат | Концентрация препарата, мкг/мл | Культура клеток | Уровень подавления накопления вируса, Δ, lg (Хср.±σхср.) | Коэффициент ингибирования, % (Хср.±σхср.) |
| Ингавирин® | 200 | GMK-AH-1(Д) | 2,3±0,1 | 99,1±0,1 |
| 100 | 1,4±0,2 | 92,2±0,2 | ||
| Арбидол® | 25 | 1,5±0,1 | 92,5±0,2 | |
| Ремантадин® | 50,0 | 4,8±0,1 | 99,99±0,1 | |
| Ингавирин® | 200 | MDCK | 2,2±0,1 | 99,4±0,1 |
| 100 | 1,4±0,1 | 96,0±0,1 | ||
| Арбидол® | 25 | 1,8±0,1 | 98,4±0,1 | |
| Ремантадин® | 50,0 | 4,9±0,1 | 99,99±0,2 |
Исторически Ремантадин является эталонным препаратом, эффективным в отношении вируса гриппа А, и применяющийся для сравнительной оценки противовирусных средств in vitro и in vivo на модельных штаммах вируса гриппа, чувствительных к нему [4, 5]. Однако проблема быстрого появления резистентных штаммов к Ремантадину (в США в сезон 2005—2006 г. циркулировало более 90% резистентных штаммов в популяции вируса гриппа А (H3N2), а в Российской Федерации в сезон 2007—2008 г. — до 77% резистентных штаммов в популяции вируса гриппа А (H3N2)) на фоне проводимого лечения гриппозной инфекции определила запрет на применение препаратов адамантанового ряда в ряде стран мира на протяжении последних трёх эпидемических сезонов [6].
Таким образом, проведённый сравнительный анализ эффективности Ингавирина® в отношении вируса гриппа А (H3N2) в чувствительных постоянных культурах клеток в сравнении с референс-препаратами (ремантадин и Арбидол® ), свидетельствует о том, что Ингавирин® эффективно подавляет цитопатическую активность вируса, формирование специфического гемагглютинина и репродукцию вируса (по накоплению) и может быть рекомендован в качестве средства выбора противовирусной терапии при гриппе.
ЛИТЕРАТУРА 1. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М.: 2005.
2. Лакин Г. Ф. Биометрия. М.: 1990.
3. Логинова С. Я., Борисевич С. В., Максимов В. А., Бондарев В. П. Оценка токсичности неспецифических медицинских противовирусных средств, предназначенных для профилактики и лечения опасных и особо опасных вирусных инфекций. Антибиотики и химиотер 2009; 54: 3-4: 11-14.
4. Saelens X., Vanlandschoot P., Martinet W. et al. Protection of mice against a lethal influenza virus challenge after immunization with yeast-derived secreted influenza virus hemagglutinin. Eur J Biochem 1999; 260: 1: 166-175.
5. Yingsakmongkon S, Miyamoto D, Sriwilaijaroen N. et al. In vitro inhibition of human influenza A virus infection by fruit-juice concentrate of Japanese plum (Prunus mume SIEB. et ZUCC). Biol Pharm Bull 2008; 31: 3: 511-515.
6. Бурцева E. И., Шевченко E. С., Белякова H. В. и др. Мониторинг чувствительности выделенных в России эпидемических штаммов вирусов гриппа к этиотропным химиопрепаратам. Вопр. вирусол 2009; 5: 25-28.
