Ускоренный и упрощенный способ определения антибактериальной активности дезинфекционных средств
СтатьиОпубликовано в журнале:
Дезинфекционное дело »» №3'99 М.И. Леви, Ю.Г. Сучков
Испытательный лабораторный центр МГЦД
Применение цветной питательной среды, больших доз бактерий и пластмассовых пластин с луночками является основой ускоренного и упрощенного способа определения антибактериальной активности дезинфекционных средств. Учет результатов испытания активности дезинфекционных средств опирается на регистрацию изменения цвета питательной среды после термостатирования смесей раствора дезинфекционного средства и взвеси бактерий, а также на учете мутности в лунках пластины.
Разработанная методика позволяет не только оценивать антибактериальную активность большинства дезинфекционных средств, но и определять устойчивость бактериальных культур (в том числе госпитальных) к дезинфекционным средствам.
Speeded and simplified determination method of disinfection preparation antibacterial activity
M.I. Levi, Yu.G. Suchkov
Experimental Laboratory Center of MMCD
The speeded and simplified determination method of disinfection preparations antibacterial activity is based on the application of colored nutritious medium, great bacteria doses and plastic planshet with cavities. The estimation of essay results of disinfection preparation activity is based on nutritious medium color changing after thermostating of disinfection preparation solution mixed with bacteria suspension as well as on mixtures turbidity estimation in planshet cavities.
The elaborated method is enable not only to estimate the antibacterial activity of majority of disinfection preparations, but also to determine the bacteria cultures resistance to disinfection preparation, including hospital bacteria cultures.
В последние годы стали появляться сообщения, в которых приведены факты появления устойчивости бактериальных культур к дезинфекционным средствам /1, 2/. Авторы этих работ убеждены, что устойчивость бактерий к дезинфектантам широко распространена среди госпитальных штаммов, в связи с чем необходим мониторинг этого явления. Но в этом случае следует обладать методиками, которые позволили бы изучать выделенные в ЛПУ и других объектах штаммы в широком ассортименте, в то время как существующие методы громоздки и трудоемки /4/.
Материалы и методы
В работе использовали музейные бактериальные культуры: Е. coli К-12, Staph.aureus 906, Вас.subtilis 168, Вас.cereus 96, Y.pestis EV, Y.pseudotuberculosis 1985 I серовар.
В работе использовали жидкую питательную среду, в состав которой входил индикатор.
В работе испытаны разные дезинфекционные средства, относящиеся к различным группам и имеющие широкое распространение в практике.
Для определения антибактериальной активности дезинфекционных средств последние титровали в плоскодонных луночках стерильных пластинок типа Titerteck, предназначенных изначально для иммуноферментного анализа. Разведения дезинфекционных средств, как и приготовление взвеси бактериальных культур осуществляли с помощью цветной питательной среды. Учет результатов вели после термостатирования при 37°С по изменению исходного цвета питательной среды и появлению мутности, которые регистрировали визуально, но возможен учет инструментальный в аппарате типа Multiscan при использовании фильтра 450 nm.
Результаты исследований
Методика основана на хорошо известном факте, что по мере роста в цветной питательной среде бактерии сдвигают рН в кислую сторону, что влечет за собой изменение цвета среды, а эффективное дезинфекционное средство, по нашему предположению, должно предотвращать конверсию цвета. Работу начали с испытания роста некоторых эталонных штаммов бактерий в питательных средах, в состав которых входили разные индикаторы - феноловый красный, бромкрезолпурпур или бромтимоловый синий. Наиболее яркий переход от исходного цвета к желтому получили при использовании питательной среды с бромкрезол-пурпуром, но наиболее чувствительной к конверсии цвета оказалась зеленая питательная среда с бромтимоловым синим. В таблице 1 приводим результаты определения скорости перехода исходного цвета в желтый в зависимости от концентрации бактерий.
Чем выше концентрация бактерий, тем скорее наступает конверсия цвета, которая оказалась необратимой. Из трех индикаторов мы выбрали бромтимоловый синий, концентрация которого в среде составила 0,002%. Что касается концентрации бактерий, то мы остановились на дозе 5*107 м. кл. в луночке. При этой концентрации достаточно было 2-3 генераций бактерий, чтобы наступила конверсия цвета питательной среды в желтый.
Таблица 1 Определение визуальным способом изменения цвета питательной среды с 0,5% глюкозы и индикатором бромтимоловым синим в результате роста бактерий
| Вид бактерий | Время изменения окраски питательной среды (часы) при посевной дозе бактерий в 0,5 мл среды | |||||||||||
| 5*107 | 3,3*107 | 1,1*107 | 4*106 | 1,3*106 | 4*105 | 1,3*105 | 4*104 | 1,3*104 | 4*103 | 1,3*103 | 4*102 | |
| E.coli K-12 | 2,5 | 2,5 | 2,5 | 2,5 | 3 | 3 | 3 | 5 | 5 | 5 | 24 | 24 |
| Staphilococcus aureus 906 | 2,5 | 2,5 | 2,5 | 3 | 3 | 4 | 4 | 5 | 5 | 24 | 24 | 24 |
| Y.pestis EV | 2,5 | 2,5 | 4 | 4 | 5 | 5 | 24 | 24 | 24 | 24 | 24 | 24 |
| Y.pseudotuberculosis 1985 I серовара | 3 | 3 | 5 | 5 | 24 | 24 | 24 | 24 | 24 | 24 | 24 | 24 |
| Вас.subtilis 168 (вегетативные) | 3 | 3 | 3 | 4 | 4 | 24 | 24 | 24 | 24 | 24 | 24 | 24 |
| Bac.cereus 96 (вегетативные) | 2,5 | 2,5 | 2,5 | 2,5 | 4 | 4 | 5 | 5 | 24 | 24 | 24 | 24 |
Таблица 2 Влияние дезинфекционного средства "Септабик" на изменение цвета питательной среды под влиянием роста бактерий
| Вид бактерий | Время изменения цвета среды (часы) при концентрации "Септабика" (%) | Контроль культуры | |||||
| 0,25 | 0,125 | 0,063 | 0,032 | 0,016 | 0,008 | ||
| E.coli | - | 5 | 5 | 5 | 4 | 4 | 4 |
| Staphilococcus aureus | - | - | 5 | 5 | 4 | 4 | 4 |
| Y.pestis EV | - | 5 | 5 | 5 | 4 | 4 | 4 |
| Y.pseudotuberculosis | - | - | 5 | 5 | 4 | 4 | 4 |
| Вас.subtilis 168 | - | - | - | >5 | >5 | >5 | 5 |
| Вас.cereus 96 | - | - | - | >5 | >5 | >5 | 5 |
| Контроль среды | - | - | - | - | - | - | |
Таблица 3 Влияние хлорамина на изменение цвета питательной среды под влиянием роста бактерий
| Вид бактерий | Время изменения цвета среды (часы) при концентрации "Септабика" (%) | Контроль культуры | |||||
| 0,25 | 0,125 | 0,063 | 0,032 | 0,016 | 0,008 | ||
| E.coli | - | - | - | 4 | 4 | 4 | 4 |
| Staphilococcus aureus | - | - | - | 4 | 4 | 4 | 4 |
| Y.pestis EV | - | - | - | 4 | 4 | 4 | 4 |
| Y.pseudotuberculosis | - | - | - | 4 | 4 | 4 | 4 |
| Вас.subtilis 168 | - | - | >5 | 5 | 4 | 4 | 4 |
| Вас.cereus 96 | - | >5 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 |
| Контроль среды | - | - | - | - | - | - | |
Таблица 4 Влияние перекиси водорода на изменение цвета питательной среды под влиянием роста бактерий
| Вид бактерий | Время изменения цвета среды (часы) при концентрации "Септабика" (%) | Контроль культуры | |||||
| 0,75 | 0,38 | 0,19 | 0,1 | 0,05 | 0,025 | ||
| E.coli | - | - | - | - | 24 | 4 | 4 |
| Staphilococcus aureus | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 |
| Y.pestis EV | 24 | 5 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 |
| Y.pseudotuberculosis | 24 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 |
| Вас.subtilis 168 | 24 | 24 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 |
| Вас.cereus 96 | - | - | 24 | 5 | 5 | 4 | 4 |
| Контроль среды | - | - | - | - | - | - | |
Таблица 5 Сопоставление рекомендованных в практике концентраций дезинфекционных средств и концентраций, которые могут быть использованы в ускоренном методе
| Наименование дезинфекционного средства | Активно-действующее вещество | Рекомендованная в практике концентрация, % | Влияние на исходный цвет питательной среды в концентрации, % | |
| изменяет цвет | не изменяет цвет | |||
| Хлорамин | Хлор | 0,5-3 | 3 | <1 |
| Септабик | Четвертичное аммониевое основание, мочевина | 0,2-3 | >0,5 | <0,2 |
| Перекись водорода | Атомарный кислород | 3-6 | >3 | <0,5 |
Однако не все виды бактерий меняют цвет среды на желтый. При внесении в питательную среду Ps.alcaligenes уже через 3 часа цвет питательной среды меняется на светлосиний, свидетельствующий не о снижении, а о повышении рН. Однако с увеличением времени светлосиний цвет под влиянием роста бактерий постепенно меняется на желтый. Поэтому в случае синегнойной палочки учет следует вести по перемене зеленого цвета на синий. Трудности возникли и с некоторыми дезинфекционными средствами, которые сами по себе изменяли цвет питательной среды. В качестве примера приводим результаты испытания средства "Септабик" (30% четвертичного аммониевого основания и 65% мочевины). Это средство применяют в концентрациях 2-0,2% по препарату /5/. Но в концентрации 1-2% "Септабик" обесцвечивает питательную среду и даже в концентрации 0,5% искажает ее исходный цвет. Поэтому испытывать действие "Септабика" на бактериальные культуры следует при концентрациях средства ниже 0,5% (таблица 2).
Все дезинфекционные средства можно в интересующем нас плане разбить на три группы, руководствуясь рН: кислые, нейтральные и щелочные. Кислые препараты характеризуются тем, что сразу же после добавления к питательной среде меняют цвет на желтый. Испытывать такие препараты можно лишь, начиная с тех концентраций, которые не искажают исходный цвет питательной среды. Аналогичным образом щелочные препараты затруднительно использовать из-за того, что сразу после добавления меняют цвет питательной среды на светлосинии. Гораздо проще обстоит дело с нейтральными дезинфекционными средствами, которые будучи добавленными к питательной среде, не искажают ее исходный цвет. В этих случаях сохранение исходного цвета свидетельствует о губительном действии дезинфекционного средства на бактерии, а изменение цвета на желтый является указанием на то, что препарат не препятствует росту бактерий, если последние не подщелачивают среду. К нейтральным дезинфекционным препаратам можно отнести хлорамин, для которого характерна слабощелочная рН (таблица 3).
Относительно высокие концентрации перекиси водорода обесцвечивали питательную среду. К тому же сразу после добавления к раствору Н2О2 бактерий начиналось обильное выделение пузырьков, обязанное каталазе, которую выделяют многие бактерии. Образование пены затрудняло учет испытаний.
На примере трех дезинфекционных препаратов - "Септабик", хлорамин, перекись водорода - можно убедиться в том, что для каждого средства следует учитывать особенности применения предлагаемой ускоренной и упрощенной методики.
Из таблицы 5 видно, что не всегда рекомендованные в практике концентрации дезинфекционных средств могут быть испытаны с помощью предлагаемой методики, но не исключает ее использование в этих случаях при более низких концентрациях, например, для сравнительных испытаний.
Избранная концентрация бактерий 5-107 м. клеток не влияла на исходный цвет питательной среды и не создавала мутности. Во время термостатирования при 37°С в лунках по мере размножения бактерий легкая мутность появляется к 4 часам для хорошо натренированного глаза. Лишь через 6 часов при 37°С мутность не вызывает сомнений. Можно поступить иначе - после 4-часовой экспозиции при 37°С оставить пластины при комнатной температуре и осуществить учет мутности на следующий день. Прибавление дезинфекционного средства к смеси бактерий и питательной среды препятствует образованию мутности и этот признак может быть использован для оценки антибактериальной активности дезинфекционных средств. В редких случаях мутность в растворе образуется не за счет бактерий, а за счет взаимодействия дезинфектанта с ингредиентами питательной среды, но это наступает сразу после смешения (Дезэффект, Бромосепт).
Итак, представленная в настоящей работе методика упрощенного и ускоренного определения антибактериальных свойств дезинфекционных средств основана на учете двух признаков - изменение цвета питательной среды и появления мутности. Изменение цвета наступает раньше и может быть учтено уже через несколько часов, но имеет ряд ограничений. Появление мутности наступает позднее, но зато лишено ряда ограничений, свойственных цветовому учету. Сочетание двух перечисленных признаков позволяет характеризовать предлагаемую методику оценки антибактериальных качеств дезинфекционных средств как упрощенную и ускоренную.
Обсуждение результатов
Техническое исполнение предлагаемой методики укладывается в несколько операций. Вначале готовят раствор дезинфекционного средства на цветной питательной среде в концентрации, несколько превосходящей ту, которая рекомендована для практического использования, если это возможно, или в той концентрации, которая не вызывает существенного изменения цвета среды. Бактериальные культуры, эталонные или испытуемые, вначале испытывают в концентрации 5-107 м. кл. на способность вызывать изменение цвета питательной среды при термостатировании. Если испытуемая культура бактерий вызывает изменение исходной окраски питательной среды в подходящие сроки, то можно ее включать в испытания в сравнении с эталонной культурой того же вида и вынести суждение о возможной устойчивости выделенной на объекте культуры к дезинфекционному средству.
Испытания ведут в 96-луночковых пластинах с плоским дном. Объем лунок - 0,2 мл. Готовят последовательные разведения дезинфекционного препарата на цветной питательной среде в объеме 0,1 мл. Затем в лунки привносят по 0,05 мл взвеси бактерий на цветной питательной среде - 5-107 м. кл. Пластины держат в термостате 37°С в течение 4 часов. Обычно этого времени достаточно, чтобы контроль культуры уже изменил свой цвет, но иногда требуется 6 часов. Если необходимости в скором учете результатов нет, то пластины переносят в комнатную температуру и учитывают на следующий день как цвет питательной среды, так и мутность (некоторые бактерии, например, бактерии чумы, успевают к этому времени осесть на дно лунок).
При использовании упрощенной и ускоренной методики не следует опасаться контаминации питательной среды в луночках посторонними бактериями, способными изменить рН среды, так как незначительное число попавших в луночки посторонних бактерий требует времени для достижения того количества, при котором возможен существенный сдвиг рН. Мы оставляли пластины с питательной средой открытыми в термостате при 37°С и только к концу 24 часа появлялись отдельные луночки. где изменялся цвет, а если такие же пластины оставляли на 4 часа при 37°С, а затем при комнатной температуре, то изменение цвета в отдельных луночках наступало на 3 сутки. Поэтому мы не очень опасались посторонних микроорганизмов и не создавали особых стерильных условий.
Те дезинфекционные препараты, рН которых существенно отклоняется от нейтральной, должны быть оценены специальным образом. Это в большей мере относится к композиционным препаратам, включающим в себя сильно кислые или щелочные компоненты.
Бондарев и др. /2/ измеряли антибактериальную активность дезинфекционных средств путем применения бумажных дисков, смоченных дезинфекционным средством по аналогии с методикой, употребляющейся для определения антибактериальной активности антибиотиков.
До сих пор наряду с определением прямого действия дезинфекционного средства на репродуктивную способность бактерий, определяемую по результатам посева на агар или в бульон, необходимо было использовать какой-либо адекватный нейтрализатор активнодействующего вещества, чтобы остановить действие дезинфектанта на бактерии после экспозиции, но перед посевом. Как известно, хлорамин удачно нейтрализуют гипосульфитом натрия, а формалин - аммиаком. Однако в других случаях катионные аммониевые основания принято нейтрализовать анионными соединениями, взятыми в эквимолярной концентрации. Наш опыт свидетельствует о том, что подобная "нейтрализация" порой неэффективна, возможно, из-за того, что взаимодействие агента и нейтрализатора обратимо. В других случаях и вовсе неизвестны эффективные и безвредные для бактерий нейтрализаторы, что затрудняет определение экспозиции, достаточной для разрушения бактерий. Не следует забывать, что в дезинфекционной практике, если и применяется экспозиция, то она достигается не применением нейтрализаторов, а чаще всего отмывкой водой дезинфекционного средства или другими способами. Поэтому применение нашей методики, ставящей своей целью упрощенное и ускоренное определение антибактериальной активности без прямого определения минимальной экспозиции, является вполне достаточным способом установления активности препарата как в сравнении с активностью других препаратов, так и самого по себе по отношению к испытуемым бактериальным культурам.
Нам пришлось исследовать несколько образцов госпитальных культур, которых бактериологи одной из больниц г. Москвы заподозрили в устойчивости по отношению к дезинфекционному препарату "Дезэффект", но с помощью предлагаемой методики подтвердить этого не удалось, так как чувствительность испытуемых культур оказалась примерно равной чувствительности эталонных бактериальных культур /6/.
Выводы
1. Применение цветных питательных сред, больших доз бактерий и пластмассовых пластин с лунками являются основой разработанной ускоренной и упрощенной методики определения антибактериальной активности дезинфекционных средств.
2. Учет результатов испытаний активности дезинфекционных средств опирается на регистрацию изменения цвета питательной среды после термостатирования смесей раствора дезинфекционных средств и бактерий, а также на визуальном учете мутности в лунках пластины.
3. Разработанная методика позволяет не тoлькo оценивать антибактериальную активность большинства дезинфекционных средств, но и испытывать предполагаемую резистентность бактериальных культур (в том числе госпитальных) к дезинфекционным средствам.
Литература
1. Авраменко B.C., Иванов А.А. Проблема устойчивости к средствам обеззараживания микрофлоры, выделенной в лечебно-профилактических учреждениях МО НИИЦ (МБЗ) НИИИЦВМ МО РФ. В кн.: "Современные технологии диагностики и терапии инфекционных болезней", с. 5-6, Санкт-Петербург, 1999.
2. Бондарев В.А., Алтайская Г.Б., Горбунова 3.А. Организация работы Липецкого областного центра дезинфекции и стерилизации по определению активности дезинфектантов к различным микроорганизмам. Дезинфекционное дело, 1999, N2, с. 4-7.
3. Леви М.И., Бессонова В.Я., Лившиц М.М. Применение цветных питательных среда процессе контроля стерилизации. Клиническая и лабораторная диагностика, 1993, N2, с. 65-67.
4. Методические указания по определению устойчивости культур микроорганизмов, контаминирующих изделия медицинского назначения в условиях производства и эксплуатации, к стерилизующим агентам. Утв. МЗ РФ 29 марта 1985 г., N28-6/7.
5. Методические указания по применению для целей дезинфекции средства "Септабик". Утв. МЗ РФ 15 апреля 1994г., N01-19/17-11.
6. Методические указания по применению средства "Дезэффект" для целей дезинфекции и предстерилизационной очистки. Утв. МЗ РФ 16 февраля 1999 г., N1100/326-99-113.
