Залаин - монография для специалистов.: Механизм действия

Статьи

Залаин

2. Механизм действия

2.1. Фунгистатический эффект

Фунгицидная активность является следствием прямого взаимодействия сертаконазола с плазматической мембраной грибов, приводящего к образованию в ней воронок и пор и вызывающего массивный выход цитоплазмы и АТФ. Это приводит к увеличению количества нежизнеспособных клеток. Структурное сходство бензотиофена и триптофана облегчает проникновение сертаконазола в плазматическую мембрану грибов. Подавление биосинтеза эргостерола (фунгистатический механизм действия, обусловленный наличием азоловой группировки) проявляется при использовании сертаконазола даже в очень низких концентрациях.

Противогрибковый эффект сертаконазола и многих других противогрибковых средств базируется на наличии в сложной структуре клеточной мембраны грибов ригидной дисковидной молекулы эргостерола. Это соединение регулирует внутреннюю "подвижность" или "текучесть" мембраны. Любой дефицит эргостерола вызывает нарушения устойчивости и плотности мембраны.

Эргостерол образуется в результате биосинтеза из более простых веществ через цепь реакций, которая включает синтез промежуточного вещества ланостерола. Ключевую роль в превращении ланостерола в эргостерол играет фермент 14-α-деметилаза (рис. 2).

Рисунок 2. Превращение ланостерола в эргостерол через ряд промежуточных этапов с удалением метильной группы у С14 14-α-деметилазой

14-α-деметилаза входит в группу ферментов, известных под общим названием цитохром Р450. Все ферменты группы цитохрома Р450 содержат гематиновый железосодержащий пигмент. Считается, что сертаконазол, подобно другим противогрибковым средствам из группы азолов, связывается с атомом железа гематиновой группы и инактивирует 14-α-деметилазу. Это приводит к нарушению синтеза эргостерола и накоплению ланостерола и других стеролов. Их включение вместо эргостерола в мембрану значительно нарушает структуру и функцию клеточной мембраны грибов (рис. 3).

Рисунок 3. Изменение свойств мембраны, вызываемое включением "ложных" стеролов вместо эргостерола

Было показано, что угнетающее действие сертаконазола на синтез эргостерола у Candida albicans является дозозависимым [2]. Сертаконазола нитрат добавляли в культуру Candida albicans в концентрациях от 2,0 × 10^-7 до 7,07 × 10^-8 моль/л через четыре часа после инокуляции. Через 24 часа культуры подвергали изучению. Эргостерол экстрагировали с использованием липофильного растворителя, а его концентрацию определяли методом жидкостной хроматографии высокого давления.

Результаты представлены в таблице 2 и на рисунке 4.

Таблица 2. Зависимое от концентрации угнетение сертаконазолом синтеза эргостерола у Candida albicans [2]

Концентрация сертаконазола (моль/л)	Концентрация эргостерола в сухом мицелии (нг/мг)	Угнетение синтеза эргостерола (в % по сравнению с контролем)
2.00 × 10-7	57.93±16,38	86.59
1.40 × 10-7	130,66±48,03	69.76
1.00 × 10-7	28,91±68,97	34.75
7.07 × 10-8	357,98±115,92	17.15
0	432,06±81,73	0

Рисунок 4. Концентрация эргостерола в сухом мицелии после культивирования в присутствии прогрессивно снижающихся концентраций сертаконазола [2] Зависимое от концентрации подавление сертаконазолом синтеза эргостерола

2.2. Специфичность действия сертаконазола на синтез эргостерола

14-α-деметилаза является монооксигеназой или гидроксилазой, т.е. фермент переносит один атом кислорода из молекулы О2 на органическую молекулу, которая становится пригодной для других реакций. Этот тип реакции весьма част в метаболических реакциях, и поэтому обычно имеется большое количество монооксигеназ. Наиболее важной группой является группа цитохрома Р450, которая состоит из нескольких сотен очень схожих отдельных ферментов, хотя каждый из них имеет специфичность в отношении определенного субстрата. Помимо 14-α-деметилазы эта группа включает также некоторые ферменты, которые играют ключевую роль в синтезе половых гормонов и гормонов коры надпочечников человека. Одним из этих ферментов является 17,20-десмолаза, которая участвует в биосинтезе тестостерона, превращая 17-α-гидроксипрогестерон в андростерон за счет отщепления боковой цепи (рис. 5).

Рисунок 5. Превращение у человека 17-α-гидроксипрогестерона в андростендион под действием 17,20-десмолазы

При использовании сертаконазола важно знать, может ли препарат, помимо ингибирования 14-α-деметилазы грибов, изменять активность какого-либо другого фермента млекопитающих, например, 17,20-десмолазы.

Ингибирование 17,20-десмолазы является нежелательным побочным эффектом, поскольку любой дефицит этого фермента вызывает нарушения половой функции у мужчин [3, 4]. Хотя эти соображения более важны в случае лечения противогрибковыми средствами, применяемыми системно, противогрибковые препараты для местного использования также должны иметь максимальную избирательность действия в отношении 14-α-деметилазы грибов.

Для изучения сертаконазола в этом аспекте была исследована активность 17,20-десмолазы, выделенной из тестикул крыс, по действию на 17-α-гидроксипрогестерон в присутствии сер-таконазола, эконазола, кетоконазола и бифоназола в различных концентрациях. Снижение активности фермента на 50% было выявлено в присутствии исследованных веществ в концентрациях, представленных в таблице 3 и на рис. 6.

Таблица 3. Влияние сертаконазола на 17,20-десмолазу является минимальным

Сертаконазол	160 нмоль/л
Эконазол:	120 нмоль/л
Кетоконазол:	30 нмоль/л
Бифоназол:	6 нмоль/л

(нмоль = наномоль= 10^-9 моль)

Таким образом, из всех изученных противогрибковых средств сертаконазол является препаратом с наименьшим ингибирующим действием на 17,20-десмолазу [5].

Рисунок 6. Ингибирование 17,20-десмолазы различными противогрибковыми средствами

2.3. Фунгицидный эффект

Фунгицидная активность сертаконазола связана с его прямым влиянием на плазматическую мембрану грибов. Это показано экспериментально с помощью измерения внеклеточной концентрации АТФ (или К+), возрастание которой (параллельно с уменьшением внутриклеточной концентрации АТФ) совпадает с быстрым снижением числа жизнеспособных грибов.

В течение метаболических процессов в грибах, особенно в течение усвоения пищи, органические вещества распадаются на более мелкие фрагменты с помощью гидролитических реакций, катализируемых ферментами, которые грибы синтезируют и секретируют в окружающую среду (экзоферменты). Белки окружающей ткани хозяина расщепляются протеазами с образованием пептидов и свободных аминокислот, которые затем поглощаются микроорганизмом. Среди этих аминокислот имеется триптофан, аминокислота с ароматической структурой.

Транспорт или баланс аминокислот играет важную роль в изменениях морфологии клетки гриба (специфичен для перехода дрожжи-мицелий). Эти изменения также важны для успешного существования гриба в организме хозяина [6, 7].

Конкурентный антагонизм с триптофаном, о котором сообщалось при исследованиях на различных ферментах, показывает, что бензо-(β)тиофеновая группировка в молекуле сертаконазола сходна по структуре и имитирует ин-дольное кольцо триптофана [8].

Изображения 2 и 3. Влияние сертаконазола на Candida albicans, наблюдаемое при сканирующей электронной микроскопии

Из-за этого структурного сходства и липофильности указанной группировки сертаконазол легче, чем триптофан, проникает в плазматическую мембрану грибов. После вхождения в мембрану соединение вследствие высокой способности селективно взаимодействовать с компонентами клеточной мембраны вызывает образование в ней воронок, каналов и пор, видимых при электронной микроскопии. Это приводит к массивному выходу электролитов (в основном АТФ) и других жизненно важных веществ из грибковых клеток.

Разрушение плазматической мембраны вызывает деструкцию скелетона клетки и гибель ее содержимого в результате лизиса органелл [9].

Действие бензотиофена может объяснять фунгицидную активность сертаконазола в низких концентрациях, отличающую препарат от других производных имидазола, а также его эффективность в отношении штаммов грибов с перекрестной резистентностью к имидазолам. Основной эффект последних обусловлен воздействием на биосинтез эргостерола и поэтому приводит лишь к подавлению роста грибов.

Фунгистатический механизм действия, связанный с наличием азоловой группировки, выявляется у сертаконазола в концентрациях, значительно меньших минимальных ингибирующих концентраций, хотя "in vivo" превалирует фунгицидное действие препарата, обусловленное его действием на клеточную мембрану грибов [2].

Рисунок 7. Структурное сходство между бензотиофеном и триптофаном

Это дополнительное и специфическое действие сертаконазола выявляется в разных ситуациях. В частности, препарат оказывает прямое токсическое влияние на клеточную мембрану грибковых клеток всего через 10 минут после начала воздействия и вызывает выход из них внутриклеточных компонентов. Так, после 10-минутного воздействия сертаконазола в возрастающих концентрациях на Candida albicans отмечалось отчетливое увеличение концентрации аденозина трифосфата (АТФ) во внеклеточной жидкости (рис. 8).

Изменение проницаемости клеточной мембраны грибов с последующим выделением клеточных компонентов вызывает гибель грибковых клеток, что обусловливает фунгицидное действие сертаконазола. Это было доказано при 10-минутном воздействии сертаконазола и кетоконазола в возрастающих концентрациях на культуры Candida albicans (рис. 9). После ре-инокуляции в соответствующем разведении после 48-часового периода инкубации определяли количество жизнеспособных колоний грибов. До воздействия препаратов их количество в чашечках Петри варьировало от 100 до 300 (рис. 9).

Рисунок 8. Демонстрация прямого токсического действия сертаконазола в высоких концентрациях на мембрану Candida albicans, обусловливающего высвобождение АТФ [10].

Сертаконазол: прямое токсическое действие на клеточную мембрану гриба. Высвобождение АТФ вследствие изменения проницаемости мембраны.

Рисунок 9. Влияние сертаконазола и кетоконазола на жизнеспособность колоний Candida albicans [10].

Далее: 3. Токсикология

Комментарии