​Cравнение аминокислотного состава хондропротекторных препаратов природного происхождения

Верниковский В.В.

Пятигорский медико-фармацевтический институт, Пятигорск, Россия

Резюме. Производство лекарственных препаратов на основе активных веществ, извлекаемых из природного сырья, представляет значительную сложность даже в современной фармацевтической индустрии. Состав препаратов, зависимость от места и времени сбора сырья, а также технологии извлечения и очистки биологически активных веществ требуют особого внимания со стороны производителя. В статье рассмотрены результаты сравнительного исследования аминокислотного состава хондропротекторных средств на основе морской рыбы, представленных на российском фармацевтическом рынке.

Ключевые слова: дегенеративно-дистрофические заболевания, аминокислоты, хондропротекторные препараты, экстракты из морской рыбы.

Для цитирования: Верниковский В.В. Сравнение аминокислотного состава хондропротекторных препаратов природного происхождения. Лекарственные средства и рациональная фармакотерапия. 2024; 2(11): 45-50. doi: 10.56356/27827259_2024_11_45

Comparison of amino acid composition of chondroprotective drugs of natural origin

Vernikovsky V.V.
Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute, Pyatigorsk, Russia

Abstract. The production of drugs based on active substances extracted from natural raw materials is a significant challenge even in the modern pharmaceutical industry. The composition of the preparations, the dependence on the place and time of collection of raw materials, as well as the technologies used for extracting and purifying biologically active substances require special attention from the manufacturer. This article examines the results of a comparative study of the amino acid composition of chondroprotective agents based on extracts from saltwater fish, presented on the Russian pharmaceutical market.

Keywords: degenerative-dystrophic diseases, amino acids, chondroprotective drugs, extracts from saltwater fish.

For citations: Vernikovsky V.V. Comparison of amino acid composition of chondroprotective drugs of natural origin. Drugs and Rational Pharmacotherapy. 2024; 2(11): 45-50. doi: 10.56356/27827259_2024_11_45

ВВЕДЕНИЕ

Дегенеративно-дистрофические заболевания костно-мышечной системы являются одной из актуальных проблем отечественного здравоохранения, имеющих как персонифицированные, связанные с выраженным болевым синдромом, так и общегосударственные, связанные с экономическим ущербом, обусловленным снижением трудоспособности граждан, аспекты. Особенностью данного состояния является вовлеченность в протекающий патологический процесс также мышц, фасеточных суставов, связок и сухожилий. В связи с этим отмечается необходимость наличия у используемых в терапии лекарственных препаратов комплексного действия, включающего как противовоспалительный эффект, так и тормозящий дегенеративные процессы соединительной ткани [1].

Способность улучшать метаболизм хрящевой ткани и обеспечивать ее регенерацию лежит в основе клинических эффектов структурно-модифицирующих лекарственных средств — хондропротекторов. Наиболее изученными и часто применяемыми представителями группы корректоров метаболизма костной и хрящевой ткани являются лекарственные препараты, содержащие хондроитина сульфат [2]. Внутри группы хондроитинсульфатов можно, в свою очередь, выделить относительно немногочисленную подгруппу лекарственных средств на основе биологически активных веществ из мелкой морской рыбы (экстракт, концентрат).

Родоначальником данной подгруппы хондропротекторов является лекарственный препарат Алфлутоп, разработка которого была начата в Румынии в Национальном институте химико-фармацевтических исследований еще в середине 1970-х гг. и завершилась только в 1993 г. Результатом работ стал стерильный раствор для инъекций, представляющий собой очищенный стандартизированный и стабилизированный концентрат из четырех видов морских рыб, содержащий гликозаминогликаны, в том числе гиалуроновую кислоту, хондроитина сульфат, дерматан сульфат, кератан сульфат, аминокислоты, макро- и микроэлементы [3].

Активным компонентом препарата является биоактивный концентрат из мелкой морской рыбы (шпрот североморский (Sprattus sprattus), семейство сельдевых (Clupeidae); мерланг черноморский (Odontogadus merlangus euxinus), семейство тресковых (Gadidae); пузанок черноморский (Alosa tanaica nordmanni), семейство сельдевых (Clupeidae); анчоус черноморский (Engraulis encrasicholus ponticus), семейство анчоусовых (Engraulidae), полученный путем экстракции с последующей депротеинизацией и делипидизацией [4].

За десятилетия применения в медицинской практике хондропротекторное и противовоспалительное действие использованной в составе композиции биологически активных веществ было доказано как экспериментально, так и в рамках многочисленных клинических исследований [3]. Этим объясняется тот факт, что в настоящее время существует ряд воспроизведенных лекарственных препаратов с близким составом.

На современном отечественном фармацевтическом рынке представлено несколько лекарственных средств на основе биоактивного экстракта из мелкой морской рыбы. Не все продукты приводят видовой состав сырья в инструкции, указывая только название субстанции — биоактивный экстракт из мелкой морской рыбы. Но есть препарат, который близок по составу к оригинальному лекарственному средству, включая сырьевые источники, — это Элтуфлоп® Био [5, 6].

Следует отметить, что эти препараты в числе прочих биоактивных веществ содержат аминокислоты, значение которых, учитывая химический состав соединительной и костной ткани человека, трудно недооценить.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Проведение сравнительного исследования аминокислотного состава хондропротекторных средств на основе биоактивных веществ из морской рыбы, представленных на российском фармацевтическом рынке.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве объектов исследования использовались следующие лекарственные препараты: Ал-флутоп («К.О.Биотехнос С.А.», Румыния), Элтуфлоп® Био (ООО «Эллара», Россия).

Аминокислотный состав исследуемых лекарственных препаратов определяли методом ВЭЖХ с использованием предварительной дериватизации.

Элюент А: смешивали 100 мл концентрата для приготовления подвижной фазы A AccQ Tag Eluent Л (Waters, кат. № WAT052890) и 1000 мл воды очищенной. Полученный раствор фильтровали через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм (Part No: AF0 — 0504, Phenomenex, США или аналогичного качества) и дегазировали.

Элюент В: ацетонитрил для хроматографии.

Элюент C: вода для хроматографии.

Дериватизационный реактив AccQ-Fluor (Waters, кат. № WAT052880) растворяли в 1 мл растворителя для реактива AccQ-Fluor при энергичном встряхивании при температуре 55 °С до полного растворения порошка (около 10 мин).

Испытуемый раствор: 1 мл препарата помещали в микрореакционный флакон с винтовой горловиной вместимостью 5 мл (Sigma-Aldrich производства Supelco, кат. № 33299, или аналогичного качества), добавляли 1 мл 6 М раствора хлористоводородной кислоты. Содержимое флакона продували азотом в течение 10 мин. Флакон укупоривали резиновой прокладкой с мембраной из политетрафторэтилена и обжимали навинчиваемой крышкой. Затем выдерживали в термостате в течение 22 ч при температуре 110°С. Гидролизат количественно переносили в мерную колбу вместимостью 10 мл при помощи 5 мл 1 М раствора натрия гидроксида для нейтрализации кислоты, после чего объем раствора доводили до метки водой.

Для приготовления холостого раствора 1 мл воды помещали в микрореакционный флакон с винтовой горловиной вместимостью 5 мл (Sigma-Aldrich производства Supelco, кат. № 33299, или аналогичного качества), добавляли 1 мл 6 М раствора хлористоводородной кислоты. Содержимое флакона продували азотом в течение 10 мин. Флакон укупоривали резиновой прокладкой с мембраной из политетрафторэтилена и обжимали навинчиваемой крышкой. Затем выдерживали в термостате в течение 22 ч при температуре 110°С. Гидролизат количественно переносили в мерную колбу вместимостью 10 мл при помощи 5 мл 1 М раствора натрия гидроксида для нейтрализации кислоты, после чего объем раствора доводили до метки водой.

В качестве калибровочной смеси использовали ампулированные концентрированные стандартные смеси 18 аминокислот (Amino Acid Standard, AAS18 — 5 мл analytical standard, Sigma-Aldrich, или аналогичного качества). К 160 мкл стандарта добавляли 840 мкл воды и перемешивали.

Рисунок 1. Хроматограмма сравнительного анализа аминокислотного состава препарата румынского производства Алфлутоп и препарата российского производства Элтуфлоп® Био

Дериватизацию приготовленных растворов проводили следующим образом. По 10 мкл раствора стандартного образца смеси аминокислот, испытуемого и холостого раствора помещали в тест-про-бирки на 150 мкл, прибавляли 70 мкл боратного буферного раствора AccQ-Fluor (производитель Waters, кат. № WAT052880), перемешивали на мешалке типа Vortex в течение 20 с. К полученному раствору добавляли 20 мкл раствора деривати-зационного реактива, немедленно перемешивали на мешалке типа Vortex в течение 20 с и нагревали при 55°С в течение 10 мин.

Пробы объемом 10 мкл анализировали на жидкостном хроматографе со спектрофотометрическим детектором при длине волны 248 нм. Хроматографическая колонка AccQ Tag (Waters, кат. № WAT052885) 150х3,9 мм, размер частиц 4 мкм. Скорость потока подвижной фазы составляла 1 мл/мин. Температура 37°С. Время хроматографирования — 50 мин.

Описанный метод предназначен для качественной идентификации аминокислот в смесях, однако поскольку площади пиков функционально связаны с количеством определяемого вещества [7], эти величины, полученные в идентичных условиях, могут быть использованы для сравнения содержания аминокислот в исследуемых препаратах.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Несмотря на декларируемую идентичность составов рассматриваемых хондропротекторных препаратов и одинаковое указываемое действующее вещество («биоактивный концентрат / экстракт из мелкой морской рыбы»), следует учитывать, что химический состав используемого природного сырья вариабелен и зависит от места и времени вылова рыбы, ее возраста и точного видового соотношения. Кроме того, причинами вариабельности составов могут быть конкретные технологии гидролиза и очистки, используемые каждым из производителей. В связи с этим нами было проведено сравнение аминокислотных составов рассматриваемых лекарственных препаратов.

Результаты сравнительного исследования аминокислотных составов препаратов румынского производства Алфлутоп и препарата российского производства Элтуфлоп® Био представлены на рисунке 1.

Анализ полученной хроматограммы позволил установить, что при идентичном аминокислотном составе лекарственных препаратов румынского производства Алфлутоп и препарата российского производства Элтуфлоп® Био между ними имеются некоторые отличия. Так, содержание аспарагиновой кислоты в препарате Элтуфлоп® Био почти в 2 раза выше, чем в препарате сравнения: площади соответствующих пиков составляют 1345,771 против 638,840. Также Элтуфлоп® Био превосходит и по содержанию аргинина (примерно в 1,86 раза): площади соответствующих пиков составляют 1163,738 против 625,431.

Одним из основных действий исследуемых лекарственных препаратов является стимуляция процесса восстановления хрящевой ткани. Хрящевая ткань человека содержит коллаген II типа, составляющий в ней до 70% от веса сухого вещества. Ключевыми аминокислотами, образующими полипептидные цепи коллагена, являются глицин, пролин и лизин, подвергающиеся в ходе коллагеногенеза гидроксилированию [8]. В связи с этим было проведено сравнение примерного количественного содержания указанных коллаге-нобразующих аминокислот (КОА) в исследуемых препаратах.

Содержание КОА в препарате румынского производства Алфлутоп и препарате российского производства Элтуфлоп® Био было сопоставимо: величины площадей пиков составляли 2126,850 и 2212,023, 1059,828 и 1142,049, 2266,071 и 2334,616 для глицина, пролина и лизина, соответственно. Таким образом, препарат Элтуфлоп® Био не уступает по данному показателю оригинальному препарату Алфлутоп.

Таким образом, исходя из примерного содержания КОА в составе препарата Элтуфлоп® Био, можно предполагать высокий положительный эффект в отношении процессов восстановления нативного коллагена в суставах и связках в ходе терапии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Сегодня активно изучается роль различных аминокислот в нормальном функционировании опорно-двигательного аппарата. Известно, что триптофан оказывает антипролиферативное действие с участием пути кинуреновой кислоты в отношении синовиальных фибробластов [9]. Концентрация триптофана и его катаболитов изменяется в зависимости от воспалительных процессов [10]. Фенилаланин и тирозин также заметно снижаются при остеоартрите [11]. Глицин — заменимая аминокислота — характеризуется многочисленными функциями, включая синтез белков, в частности коллагена и эластина, и играет фундаментальную роль в синтезе аденозинтрифосфата. Коллаген является основным белком соединительной ткани, а его структурной единицей является тропоколлаген — белок, образованный тремя полипептидными цепями. Все молекулы тропоколлагена состоят из одной и той же последовательности аминокислот: глицин, пролин и третья аминокислота или глицин, гидроксипролин и третья аминокислота. Поскольку коллаген (особенно коллаген II типа) является основным белком, составляющим хрящ, его присутствие является фундаментальным фактором сохранения суставов. В исследовании Dai M. et al., проведенном в 2018 г. [12], было отмечено, что увеличение коллагена и глицина предотвращало возникновение патологий суставов у животных, в частности остеоартрита. Низкие концентрации этой аминокислоты в синовиальной жидкости приводят к уменьшению количества коллагена и хряща и, как следствие, к повреждению суставов. Аспарагин — это заменимая аминокислота, уровень которой может быть снижен при остеоартрите. Известно, что она участвует в цикле мочевины, глюконеогенезе и синтезе нейротрансмиттеров. Есть некоторые доказательства того, что удаление аспарагина из культуральной среды ухудшает пролиферацию клеток и вызывает остановку клеточного цикла [13]. На этом основании можно предположить, что аспарагин может влиять на пролиферацию клеток при заболевании суставов, хотя его роль в метаболизме суставов требует дальнейших исследований. Другая заменимая аминокислота — глутамин участвует в различных биологических функциях, включая перенос аминогрупп, предшественников глутамата и глутатиона, энергетическую поддержку лимфоцитов, макрофагов и энтероцитов, стимулятор синтеза нуклеотидов и индуктор экспрессии белков теплового шока, способных подавлять воспалительную реакцию. Белки теплового шока выполняют фундаментальную защитную функцию, и недостаток этих белков может привести к клеточному апоптозу и повреждению тканей [14]. В 2017 г. исследование, проведенное Takahashi S. et al., продемонстрировало более высокую пролиферацию фибробластоподобных синовиоцитов после экзогенного введения глутамина крысам и большее потребление глутамина при воспалительных заболеваниях суставов [15]. Аргинин — аминокислота, классифицируемая как условно незаменимая, способствует окислению жирных кислот, повышает активность липолитических ферментов и снижает резистентность к инсулину [16]. Аргинин также является субстратом в цикле NO, и его метаболизм подавляется при дегенеративно-дистрофических заболеваниях опорно-двигательного аппарата, что обеспечивает дополнительную поддержку измененного метаболизма NO. Кроме того, аргинин (вместе с цитруллином) также является промежуточной молекулой в цикле мочевины, который производит NO в качестве побочного продукта через синтазу оксида азота. Эти результаты свидетельствуют о том, что окислительный стресс играет роль в патогенезе заболеваний суставов [17]. Метионин — незаменимая аминокислота с выраженным антиоксидантным и стабилизирующим структуру белка действием [18]. Исследование Li C. et al. (2020) [19] изучало роль некоторых аминокислот, включая метионин, в заболеваниях суставов человека, в результате было показано, что снижение концентрации аминокислот в основном связано с повышенным потреблением во время воспалительных процессов в суставах.

Таким образом, роль аминокислот в лечении заболеваний опорно-двигательного аппарата вызывает все больший интерес среди ученых. Аминокислоты служат основными строительными блоками белков, включая коллаген и эластин, которые имеют ключевое значение для здоровья костей, сухожилий, связок и мышц, оказывая положительное влияние на восстановление и регенерацию тканей.

Исследование аминокислотного состава рассмотренных в данной работе природных хондропротекторных средств показало, что препарат Элтуфлоп® Био российской компании «Эллара» не уступает по данному показателю препарату румынского производства Алфлутоп и даже превосходит его по содержанию некоторых аминокислот (аспарагиновой кислоты и аргинина). Благодаря такому аминокислотному составу препарат Элтуф-лоп® Био высокоэффективен при лечении заболеваний опорно-двигательного аппарата.

Производство воспроизведенных лекарственных препаратов на базе действующих веществ, получаемых из природного сырья, является крайне трудной задачей даже на современном уровне развития фармации. Сложность состава, его высокая зависимость от места и времени сбора сырья, большое влияние технологий выделения и очистки суммарных композиций биологически активных веществ требуют крайне ответственного подхода со стороны компании-производителя. Препарат Элтуфлоп® Био производится отечественной компанией «Эл-лара», которая уделяет большое внимание высокому качеству производства лекарственных средств и их доступности для потребителя.

Сведения об авторе:
Верниковский Владислав Владиславович — к.б.н., доцент кафедры фармацевтической технологии с курсом медицинской биотехнологии, Пятигорский медико-фармацевтический институт, г. Пятигорск.

Литература:

1. Кузнецова Е.Б., Кузнецов Н.С. Хондропротекторы в комплексной терапии неспецифической боли в спине: оценка эффективности. Consilium Medicum. 2023;25(11)6741–745. doi: 10.26442/20751753 .2023.11.202482.

2. Шутеева Т.В. Роль структурно-модифицирующих препаратов в лечении боли в спине. Терапевтический архив. 2023;95(8):648–651. doi: 10.26442/00403660.2023.08.202315.

3. Хасенова Г.П. Алфлутоп в практике врача (обзор литературы). Междунар. неврол. журн. 2017;6(92).

4. И нструкция по медицинскому применению препарата Алфлутоп. Форма выпуска: раствор для инъекций. П N012210/01-020221.

5. К узнецова Е.Б., Кузнецов Н.С. Хондропротекторы в комплексной терапии неспецифической боли в спине: оценка эффективности. Consilium Medicum. 2023;11.

6. И нструкция по медицинскому применению препарата Элтуфлоп® Био. Форма выпуска: раствор для инъекций. ЛП-№(001474)-(РГ-RU).

7. О ФС.1.2.1.2.0005 Высокоэффективная жидкостная хроматография (утв. приказом Минздрава России от 20.07.2023 № 377; дата введения в действие 01.09.2023).

8. Д ыдыкина И.С., Коваленко П.С., Коваленко А.А., Аболешина А.В. Значение неденатурированного коллагена для нормализации функции хрящевой ткани суставов. Медицинский Совет. 2022;(14):145–153. https://doi.org/10.21518/ 2079-701X-2022-16-14-145-153.

9. P arada-Turska J., Zgrajka W., Majdan M. Kynurenic Acid in Synovial Fluid and Serum of Patients with Rheumatoid Arthritis, Spondyloarthropathy, and Osteoarthritis. J. Rheumatol. 2013;40:903–909.

10. Kang K.Y., Lee S.H., Jung S.M., Park S.H., Jung B.H., Ju J.H. Downregulation of Tryptophan-Related Metabolomic Profile in Rheumatoid Arthritis Synovial Fluid. J. Rheumatol. 2015;42:2003–2011.

11. Wishart D.S., Tzur D., Knox C. et al. HMDB: The Human Metabolome Database. Nucleic Acids Res. 2007;35:D521-6.

12. Dai M., Sui B., Xue Y., Liu X., Sun J. Cartilage Repair in Degenerative Osteoarthritis Mediated by Squid Type II Collagen via Immunomodulating Activation of M2 Macrophages, Inhibiting Apoptosis and Hypertrophy of Chondrocytes. Biomaterials. 2018;180:91–103.

13. Deng L., Yao P., Li L., Ji F., Zhao S., Xu C., Lan X., Jiang P. P53-Mediated Control of Aspartate-Asparagine Homeostasis Dictates LKB1 Activity and Modulates Cell Survival. Nat. Commun. 2020;11:1755.

14. Kim H. Glutamine as an Immunonutrient. Yonsei Med. J. 2011;52:892–897.

15. Takahashi S., Saegusa J., Sendo S., Okano T., Akashi K., Irino Y., Morinobu A. Glutaminase 1 Plays a Key Role in the Cell Growth of Fibroblast-like Synoviocytes in Rheumatoid Arthritis. Arthritis Res. Ther. 2017;19:76.

16. McNeal C.J., Meininger C.J., Reddy D., Wilborn C.D., Wu G. Safety and Effectiveness of Arginine in Adults. J. Nutr. 2016;146:2587S–2593S.

17. McNeal C.J., Meininger C.J., Reddy D., Wilborn C.D., Wu G. Safety and Effectiveness of Arginine in Adults. J. Nutr. 2016;146:2587S–2593S.

18. Aledo J.C. Methionine in Proteins: The Cinderella of the Proteinogenic Amino Acids. Protein Sci. 2019;28:1785–1796.

19. Li C., Chen B., Fang Z., Leng Y.F., Wang D.W., Chen F.Q., Xu X., Sun Z. Ling Metabolomics in the Development and Progression of Rheumatoid Arthritis: A Systematic Review. Jt. Bone Spine. 2020;87:425–430.

20. Adams S.B., Setton L.A., Kensicki E., Bolognesi M.P., Toth A.P., Nettles D.L. Global Metabolic Profiling of Human Osteoarthritic Synovium. Osteoarthr. Cartil. 2012;20;64–67.

Комментарии