Обзор механизмов аллергии. Эбастин обладает не только антигистаминным эффектом
Статьи
Alison Campbell,1 François-Bernard Michel,1 Clotilde Bremard-Oury,2 Louis Crampette3 и Jean Bousquet1
1. Service des Maladies Respiratoires&INSERM U454 Hôpital Arnaud de Villeneuve, Монпелье, Франция
2. Rhône-Poulenc Rorer, SPECIA, Париж, Франция
3. Service d’ORL, Hôpital Saint Charles, Монпелье, Франция
Резюме
Антагонисты гистамина, также как и стероиды для местного применения, являются препаратами выбора при аллергическом рините. Многие из этих антагонистов гистамина проявляют дополнительные эффекты, кроме блокады гистаминового рецептора. В этом исследовании мы изучали влияние эбастина и каребастина на выделение эйкозаноидов и цитокинов из изолированных человеческих клеток назальных полипов и влияние данных веществ на высвобождение медиаторов воспаления в жидкость, полученную в результате назального лаважа, после провокационной пробы с аллергеном. Было показано, что эбастин блокирует индуцированное антителами к иммуноглобулину Е высвобождение простагландина D2 (PgD2) и лейкотриенов C4/D4 из клеток носового полипа человека (значения 30% ингибирующей концентрации (IC30) 2,57 и 9,6 мкмоль/л соответственно) и ингибирует высвобождение цитокинов. Каребастин ингибировал высвобождение простагландина D2 (PgD2) (значения 30% ингибирующей концентрации (IC30) 8,14 мкмоль/л), но оказывал слабое воздействие на высвобождение цитокинов. При проведении пациентам назальной провокационной пробы с аллергеном, эбастин значительно повышал среднее количество пыльцевых зерен, необходимых для того, чтобы вызвать аллергическую реакцию. Кроме того, лекарственный препарат ингибировал высвобождение колониестимулирующего фактора гранулоцитов и макрофагов, но не оказывал никакого действия на все остальные медиаторы, определение концентрации которых проводилось.
Антагонисты Н1 гистаминового рецептора, также как и стероиды для местного применения, остаются препаратами выбора при аллергическом рините. Не считая сильного антигистаминного эффекта, механизм действия антагонистов Н1 гистаминового рецептора требуют дальнейшего изучения, поскольку они обладают свойствами, которые не связаны с блокировкой гистамина на уровне его рецептора. [1]
Для оценки противоаллергических свойств антагонистов Н1 гистаминового рецептора могут быть использованы тесты как in vitro так и in vivo. Клетки, изолированные из носовых полипов, представляют интересную модель для изучения фармакологии противоаллергических и противоастматических лекарственных препаратов, поскольку они происходят из воспаленной ткани и являются сенсибилизированными, подобно клетками при воспалении, обусловленном ринитом. [2-5]
Носовые полипы, которые могут быть различной этиологии, характеризируются наличием гиперплазированной отекшей слизистой оболочки, и произрастают из этмоидальных пазух. [6] Из клеток носового полипа высвобождаются многочисленные разнообразные медиаторы, принимающие участие в аллергической реакции, среди которых эйкозаноиды, гистамин и цитокины. После пассивной сенсибилизации клетки носового полипа могут быть активированы зависимым от антител к иммуноглобулину Е механизмом для высвобождения многих из этих медиаторов.
Мы провели исследование с использованием изолированных клеток, полученных из удаленных хирургическим путем носовых полипов, с целью изучения влияния эбастина и каребастина in vitro на высвобождение эйкозаноидов [лейкотриенов C4/D4 (LTC4/D4) и простагландина D2(PGD2)] после стимуляции антителами к иммуноглобулину Е и спонтанное высвобождение цитокинов [колониестимулирующего фактора гранулоцитов и макрофагов (GM-CSF), фактора некроза опухолей-α (TNF-α) и интерлейкина-8 (IL-8)].
Назальная провокационная проба с аллергенами широко применялась для изучения противоаллергической активности антагонистов Н1 гистаминового рецептора in vivo. Лаваж слизистой носа после воздействия аллергенов дает возможность получить и измерить концентрацию воспалительных медиаторов и цитокинов, [1,7,8] высвобождение которых может быть блокировано антагонистами Н1 гистаминового рецептора. С целью измерения влияния эбастина на высвобождение медиаторов аллергии in vivo, мы сравнивали действие эбастина в дозировке 10 мг и 20 мг один раз в сутки на высвобождение медиаторов воспаления, с действием плацебо, в двойном слепом перекрестном исследовании с участием 12 пациентов с сезонным аллергическим ринитом.
1. Материалы и методы
1.1 Исследование носового полипа in vitro
Клетки носового полипа были получены от 10 пациентов (6 мужчин, 4 женщины в возрасте от 18 до 61 года) с полипозом носа. Клетки были изолированы согласно методике, раннее применявшейся для получения клеток паренхимы легких, поскольку было обнаружено, что клетки, полученные путем ферментации, могут быть использованы для фармакологических исследований. [9]
Полип сперва рассекался ножницами на кусочки размером приблизительно 1 мм3, а разъединение клеток проводилось путем ферментативного расщепления модифицированным методом Holgate и др.[10.11] Рассеченная ткань полипа в течение двух часов находилась в четырех объемах среды для культивирования RPMI (среда Института имени Розуэелла Парка) линии 1640 (фирма «Гибко» (Gibco), Пейсли, Шотландия), которая содержит гиалуронидазу в концентрации 0,75 г/л, коллагеназу в концентрации 1,5 г/л и протеазу типа XIV в концентрации 2 г/л (все получено из компании «Сигма» (Sigma Co.), Сент-Луис, Миссури). Изоляция клеток проводилась при 37°С в качающейся водяной бане. В конце периода ферментативного расщепления клетки последовательно отфильтровывались, с целью отделения от нерасщепленной ткани. Затем они повторно растворялись в среде RPMI и троекратно отмывались для удаления ферментов. Клетки были сенсибилизированы путем инкубации с 10% атопической сывороткой при 37°С в течение 1 часа, а затем снова трижды отмыты.
Жизнеспособность клеток оценивалась до стимуляции и в конце периода инкубации путем измерения вытеснения красителя трипанового синего. Клетки описывались на стеклах, приготовленных путем центрифугирования, и окрашиванных по Май Грюнвальду – Гимзе (May Grunwald Giemsa).
С целью измерения влияния эбастина и его метаболита каребастина на высвобождение медиаторов воспаления, подготовленные клетки носового полипа были повторно растворены в среде RPMI с концентрацией 1*106 клеток/мл и в течение 20 минут преинкубированы с эбастином или каребастином (в концентрации 0,1, 1, и 10 мкмоль/л) или с растворителем, который использовался для растворения веществ [диметилсульфоксид (DMSO) в конечной концентрации 0,1%]. Затем, с целью измерения эйкозаноидов, они подвергались воздействию специфических ε-цепей антител к иммуноглобулину Е [компания «Иммунотех» (Immunotech), Люмини, Франция] в концентрации 10 мг/л в течение 45 минут при 37°С. Для измерения цитокинов клетки инкубировались в течение 24 часов без каких-либо стимуляторов секреции.
Для измерения высвобождения медиаторов лейкотриенов C4/D4 (LTC4/D4) и простагландина D2(PGD2) использовался имеющийся в продаже набор для иммуноферментного анализа (EIA) (Stallergenes, Френ, Франция), а цитокины (колониестимулирующий фактор гранулоцитов и макрофагов (GM-CSF), фактор некроза опухолей-α (TNF-α) и интерлейкин-8 (IL-8)) измерялись твердофазным иммуноферментным анализом (ELISA) (компания «Гензим» (Genzyme), Кембридж, Массачусетс, США).
1.2 Исследование активности эбастина in vivo.
Исследование носовой провокационной пробы было проведено с участием 12 пациентов в возрасте от 20 до 38 лет после получения их информированного согласия. Исследование было разрешено Этическим комитетом университета Монпелье (Montpellier University). У пациентов наблюдались симптомы сезонного аллергического ринита и положительные кожные пробы с 1/100 (вес/объем) стандартизированного экстракта пыльцы ежи сборной (Dactylis glomerata) (компания «Лаборатории Сталлергенес» (Laboratories des Stallergenes), Френ, Франция). У всех пациентов наблюдалось повышение титров иммуноглобулина Е к пыльце ежи сборной в плазме крови (радиоаллергосорбентный тест «Фадебаст» (Phadebast RAST); компания «Фармация Диагностикс» (Pharmacia Diagnostics), Упсала, Швеция). Никто из пациентов не получал лечения антигистаминными препаратами, кортикостероидами или кетотифеном в течение 2 недель до начала исследования, а также астемизолом или имипрамином в течение предыдущего месяца.
Назальная провокационная проба проводилась в то время, когда никакой специфической пыльцы в атмосфере не обнаруживалось. Капсулы, содержащие лактозу или зерна пыльцы ежи сборной в количестве, увеличивающемся от 50 до 156250 зерен (5*5-кратное увеличение) [Laboratoires des Stallergènes, Френ, Франция], инсуфлировались в ноздри носовым аэрозолем «Spinhaler» (компания «Лаборатории Фисонс» (Fisons Laboratories), Лафборо, Англия); пациенты задерживали дыхание при инсуфляции. Для каждого количества пыльцы носовой аэрозоль «Spinhaler» применяли 5 раз. Каждая капсула раскрывалась после инсуфляции, с целью убедиться, что она полностью пуста.
Сначала инсуфлировалась лактоза, и последующие симптомы регистрировались в течение 15 минут. Затем каждые 15 минут в ноздри инсуфлировались зерна пыльцы в порядке увеличения количества до тех пор, пока по шкале симптомов не получали 5 баллов: 5 последовательных чиханий (3 балла), ринорея (от 1 до 3 баллов), заложенность носа (от 1 до 3 баллов) или зуд в носу (1 балл). Назальная провокационная проба проводилась путем инсуфляции зерен пыльцы ежи сборной в количестве, увеличивающемся от 50 до 781250 (6*5 кратное увеличение) до тех пор, пока суммарный балл по шкале симптомов не достигнет исходного уровня. [12]
Выделения из носа получали путем назального лаважа до реакции и в течение ранней и поздней фаз реакции. До каждой провокационной пробы проводился лаваж каждой ноздри 5 мл физиологического раствора троекратно с целью уменьшения уровня медиаторов. Назальный лаваж также проводился через 15 минут после вдувания лактозы или аллергена и повторялся через 6 часов после немедленной реакции (поздняя фаза реакции).
Выделения из носа хранились на льду до конца эксперимента. Затем они центрифугировались при +4°С в течении 15 минут при 15000 g. Твердая фаза отделялась от гелеобразной фазы пипеткой и хранилась при -20°С до момента проведения анализа.
Для измерения высвобождения медиаторов лейкотриенов C4/D4 (LTC4/D4) и простагландина D2(PGD2) использовался имеющийся в продаже набор для иммуноферментного анализа (EIA) (Stallergenes, Френ, Франция), а цитокины (колониестимулирующий фактор гранулоцитов и макрофагов (GM-CSF), фактор некроза опухолей-α (TNF-α) и интерлейкин-8 (IL-8)) измерялись твердофазным иммуноферментным анализом (ELISA) (компания «Гензим» (Genzyme), Кембридж, Массачусетс, США).
Первая назальная провокационная проба проводилась до какого-либо лечения для определения исходной реактивности пациентов по отношению к аллергенам. С целью измерения влияния эбастина на аллергическую реакцию, пациенты получали лечение плацебо или эбастин в дозировке 10 мг или 20 мг один раз в сутки в течение 7 дней, согласно плану перекрестного исследования. Интервал между последним приемом лекарственного препарата и аллергической пробой составлял 1 час. Назальные провокационные пробы проводились в конце каждого периода лечения с 7–дневным периодом «отмывки» между периодами лечения.
2. Результаты
2.1 Исследование носового полипа in vitro
Популяция клеток полученных из носовых полипов включала эпителиальные клетки, мононуклеарные клетки, эозинофилы и нейтрофилы. Однако наблюдалась высокая степень гетерогенности полипов по клеточному составу. Ни эбастин, ни каребастин не оказывали никакого влияния на жизнеспособность клеток, определенную по захвату красителя трипанового синего.
Антитела к иммуноглобулину Е вызывали значительное усиление высвобождения LTC4/D4 и PgD2 из клеток носового полипа in vitro: спонтанное высвобождение (среднее ± стандартное отклонение (SD)) по сравнению с индуцированным антителами к иммуноглобулину Е высвобождением было 0,11±0,11 против 1,46±2,2 нг/106 клеток для PgD2 и 0,13±0,04 против 2,16±0,92 нг/106 клеток для LTC4/D4.
Эбастин в диапазоне концентраций от 0,1 до 10 мкмоль/л значительно ингибировал это высвобождение PgD2 и LTC4/D с дозозависимым эффектом (таблица 1). Концентрации эбастина, необходимые для ингибирования высвобождения этих двух медиаторов на 30% (IC30) были рассчитаны как 2,57 и 9,6 мкмоль/л соответственно. Каребастин также проявил способность ингибировать высвобождение PgD2 из клеток носового полипа, но был менее активным, чем эбастин: значение 30% ингибирующей концентрации (IC30) - 8,14 мкмоль/л. Эбастин и каребастин также ингибировали высвобождение цитокинов, хотя каребастин оказывал, в целом, меньшее влияние на эти медиаторы (таблица 1).
Таблица 1. Влияние эбастина и каребастина на высвобождение медиаторов из изолированных человеческих клеток носового полипа.
| Максимальное высвобождение нг/миллион клеток | Средний процент ингибирования | ||||||
| эбастин (мкмоль/л) | каребастин (мкмоль/л) | ||||||
| 0,1 | 1 | 10 | 0,1 | 1 | 10 | ||
| PgD2 | 1,46±2,2 | 16* | 34** | 50** | 11* | 14** | 31** |
| LTC4/D4 | 2,16±0,92 | 12 | 20** | 33** | 5 | 6* | 12* |
| TNFα | 448±390 | 15 | 10 | 40** | 11 | 15 | 25 |
| GM-CSF | 11±67 | 4 | 1 | 35* | 6 | 3 | 8 |
| IL-8 | 1046±363 | 0 | 12 | 52* | 0 | 8 | 21 |
Аббревиатуры и символы: GM-CSF = колониестимулирующий фактор гранулоцитов и макрофагов, IL-8 = интерлейкин-8, LTC4/D4 = лейкотриен C4/D4, PgD2 = простагландина D2 , TNFα = фактор некроза опухолей-α . * р<0,05, **р<0,005
2.2 Исследование активности эбастина in vivo.
Среднее количество зерен пыльцы, необходимое для индукции аллергической реакции, было достоверно ниже у принимавших плацебо, по сравнению с теми, кто принимал эбастин в дозировке 10 и 20 мг (рисунок 1). Эбастин в дозировке 20 мг вызывал достоверное повышение среднего порогового количества зерен пыльцы, необходимого для индукции положительного ответа, по сравнению с плацебо (р<0,003) и эбастином в дозировке 10 мг (р<0,02).
Эбастин уменьшал высвобождение колониестимулирующего фактора гранулоцитов и макрофагов (GM-CSF) с дозозависимым эффектом (рисунок 2). Высвобождение лейкотриена LTC4/D4 и PgD2, обнаруженное у большинства пациентов при назальной провокационной пробе, достоверно не нарушалось под влиянием эбастина. Кроме того, эбастин не влиял на высвобождение цитокинов.
Клинически поздняя фаза реакции (заложенность носа, в итоге сопровождавшаяся ринореей) наблюдалась у крайне небольшого количества пациентов, недостаточного для исследования.
Рисунок 1. Среднее пороговое количество зерен пыльцы, необходимое для индукции аллергического ответа у 12 пациентов, получавших лечение плацебо или эбастином (Е) в дозировке 10 мг или 20 мг один раз в сутки в течение 7 дней.
Примечания переводчика: Placebo- плацебо, mg – мг.
Рисунок 2. Высвобождение колониестимулирующего фактора гранулоцитов и макрофагов (GM-CSF) через 6 часов после назальной провокационной пробы с аллергеном у 12 пациентов, получавших лечение плацебо или эбастином (Е) в дозировке 10 мг или 20 мг один раз в сутки в течение 7 дней.
3. Обсуждение.
Как было уже показано ранее с применением назальной провокационной пробы с аллергеном, азатидин, лоратидин и терфенадин ингибируют высвобождение гистамина, PgD2 и кининов. [1,13-15] Кроме того, азеластин и цетиризин ингибируют высвобождение лейкотриенов. [15,16] Мы показали, что эбастин блокирует высвобождение индуцированных антителами к иммуноглобулину Е простагландина D2 (PgD2) и лейкотриенов C4/D4 (LTC4/D4) из человеческих клеток носового полипа in vitro и ингибирует высвобождение цитокинов. Ни в каких других исследованиях не применялась данная модель с целью исследования влияния других антигистаминных препаратов на высвобождение медиаторов in vitro; таким образом, не представляется возможным сравнить эти препараты с эбастином. Механизмы, с помощью которых антигистаминные препараты нарушают высвобождение медиатора, остаются неописанными.
4. Заключение.
Таким образом, эбастин, антагонист Н1 гистаминового рецептора, имеет способность ингибировать высвобождение лейкотриена C4/D4 (LTC4/D4), простагландина D2 (PgD2) и цитокинов из клеток полипа носа in vitro. Каребастин угнетает высвобождение простагландина D2 (PgD2), но в целом имеет меньшее, чем эбастин, влияние на этот и другие медиаторы. У пациентов с сезонным аллергическим ринитом эбастин в дозировке 10 и 20 мг один раз в сутки в течение 7 дней достоверно повышал количество зерен пыльцы, необходимых для индукции аллергического ответа, по сравнению с плацебо, а также уменьшал высвобождение колониестимулирующего фактора гранулоцитов и макрофагов (GM-CSF).
Ссылки на литературу.
Корреспонденция и репринты: Service des Maladies Respiratoires, Hôpital Arnaud de Villeneuve
