Барьерный рифБарьерный риф

Обеззараживатель воздуха (генератор диоксида хлора)


Инструкции:

Исследование ингаляционной токсичности газообразного диоксида хлора при общем воздействии на крыс в течение десяти недель

Комментарии

Опубликовано в журнале:
Журнал токсикологических исследований метаболизма лекарственных средств (J Drug Metab Toxicol) 2013, 4:2

Норио Огата*, Томоко Коизуми и Фумихиро Озава
Научно-исследовательский институт, Таико Фармасьютикал Ко., Лтд. (Taiko Pharmaceutical Co., Ltd.), Суита, Осака 564-0032, Япония

* Автор, отвечающий за переписку: Норио Огата, доктор медицинских наук, доктор философии, Научно-исследовательский институт, Taiko Pharmaceutical Co., Ltd., 3-34-14 Учихонмачи, Суита, Осака 564-0032, Япония.

Резюме

Газообразный диоксид хлора (ClO2) способен обеспечивать защиту против гриппозной вирусной инфекции в концентрации 0,03 частей на миллион (объемное соотношение), которая считается нетоксичной для людей. Это указывает на возможность разработки принципиального нового метода профилактики инфекционных заболеваний, передаваемыми воздушно-капельным путем.
Указанный метод может применяться, в частности, для борьбы с высокопатогенным вирусом гриппа H5N1, поскольку в настоящее время не существует безопасного и эффективного средства защиты против H5N1. Тем не менее, отсутствует полная уверенность в безопасности газообразного ClO2 как средства защиты против вирусной инфекции; в частности, нет уверенности в том, действительно ли концентрация 0,03 частей на миллион является нетоксичной при использовании в качестве средства профилактики заболевания людей в закрытых или полузакрытых помещениях.
Ввиду высокой значимости и полезности лечебного эффекта от использования газообразного ClO2 в низкой концентрации, представляется крайне важным определить «уровень ненаблюдаемого вредного воздействия» (NOAEL) газообразного ClO2. В 1972 году Поле и Дебрусс установили, что «уровень наименьшего наблюдаемого вредного воздействия» (LOAEL) газообразного ClO2 составляет 1 часть на миллион. Мы попытались подтвердить полученные ими данные в тщательно рассчитанных экспериментальных условиях. Мы выполнили исследование ингаляционной токсичности газообразного ClO2 при его общем воздействии на крыс в концентрации 1 часть на миллион 5 часов в сутки, 5 дней в неделю в течение десятинедельного периода. На крыс воздействовали газообразным ClO2 в тщательно контролируемой низкой концентрации. В указанных экспериментальных условиях не было выявлено какого-либо неблагоприятного воздействия, в отличие от результатов исследования Поле и Дебрусса. Мы пришли к выводу о том, что уровень ненаблюдаемого вредного воздействия газообразного ClO2 в описанных экспериментальных условиях составляет 1 ppm. Мы надеемся на то, что полученный нами результат позволит разработать средство профилактики микробных инфекционных заболеваний человека, передаваемых воздушно-капельным путем.
Ключевые слова: Диоксид хлора; ClO2; газ; ингаляция; токсичность; общее воздействие; крыса

Введение

С распространением высокопатогенного вируса птичьего гриппа типа H5N1 [1] возникла серьезная угроза для здоровья людей, поскольку в настоящее время не существует эффективного способа борьбы с этой инфекцией, передаваемой воздушно-капельным путем. Это особенно актуально во время длительных авиаперелетов, когда люди находятся в течение долгого времени в полностью замкнутом пространстве. Невозможно осуществить дезинфекцию салона воздушного суда путем окуривания без эвакуации пассажиров. Отмечается насущная потребность в высокоэффективном вирулицидном препарате, который можно было бы использовать в закрытых или полузакрытых помещениях без эвакуации людей. Подобный препарат мог бы использоваться в закрытых или полузакрытых помещениях, таких как салоны воздушных судов, больницы, театры и жилые здания.

Огата и Шибата в своем недавнем исследовании доказали, что газообразный диоксид хлора (ClO2) в низкой концентрации способен защищать мышей от вируса гриппа, присутствующего в воздухе в виде аэрозоля [2]. Огата описал механизм защитного действия газообразного ClO2 против вируса гриппа на молекулярном уровне [3,4]. Концентрация газообразного ClO2 в работе [2] составила 0,03 ppm (об.) (частей на миллион, объемное соотношение) (83 мкм/м³), при этом мыши, которых подвергли воздействию газа в указанной концентрации, оставались внешне здоровыми, несмотря на присутствие фатального количества вирусов гриппа [2]. Этот факт подтверждает возможность безопасного использования газообразного ClO2, для защиты животных от инфицирования патогенными организмами, передаваемыми воздушно-капельным путем. С другой стороны, в ряде исследований указано, что газообразный ClO2 в высоких концентрациях токсичен для животных [5–8]. В этой связи представляется важным установить, какая именно концентрация газообразного ClO2 может использоваться для защиты людей от микробных инфекций без необходимости их эвакуации. В частности, нас очень заинтересовало токсикологическое исследование, выполненном Поле и Дебруссом [6–8], а также возможность воспроизведения полученных ими результатов при повторении созданных ими экспериментальных условий [7]. По их свидетельству, воздействие газообразного ClO2 в концентрации 1 ppm (2,8 мг/м³) на крыс привело к полнокровию легочных кровеносных сосудов всех диаметров и к незначительному интерстициальному отеку слизистой оболочки трахеи и стенок бронх в ходе десятинедельного исследования ингаляционной токсичности [7]. На основании полученных ими результатов Агентство по охране окружающей среды США (EPA) установило «уровень наименьшего наблюдаемого вредного воздействия» (LOAEL) ингаляционной токсичности ClO2 на уровне 1 ppm (http://www.epa.gov/IRIS/subset/0496.htm). Возможно, отчет EPA послужил препятствием для широкого использования газообразного ClO2 в качестве средства защиты против инфекционных микробных заболеваний, передаваемых воздушно-капельным путем. В настоящей работе мы показали, что в строго контролируемых экспериментальных условиях мы не смогли воспроизвести полученные вышеупомянутыми авторами результаты [7]. Основываясь на выводах настоящего исследования, мы утверждаем, что «уровень ненаблюдаемого вредного воздействия» (NOAEL), а не LOAEL, газообразного ClO2 составляет 1 ppm. Полученные нами результаты служат обоснованием для безопасного использования газообразного ClO2 в низкой концентрации (<1 ppm) в качестве средства защиты против патогенных микроорганизмов, переносимых воздушно-капельным путем.

Материалы и методы

Животные и реагенты

Крысы Уистара, самки и самцы (в возрасте 5 недель) были приобретены в лаборатории Charles River (г. Йокогама, Япония). Перед началом эксперимента они прошли акклиматизацию в течение одной недели. Пара однополых животных помещались в клетку размерами 25×38×15 (высота) см из нержавеющей стали. Затем клетка помещалась в более просторную «экспериментальную камеру», где крысы контактировали со смесью газообразного ClO2 с воздухом или только с воздухом. В каждой экспериментальной камере находилось 16 крыс (8 самцов и 8 самок) в 8 клетках. Экспериментальные камеры были установлены в виварии, где поддерживались температура 24±3°C и относительная влажность воздуха 50±10%, а также был создан режим 12-часового цикла чередования светлого и темного времени суток. Корм (CRF-1 производства компании Oriental Yeast, г. Токио, Япония) и водопроводная вода давались крысам ad libitum. Все эксперименты над животными проводились в строгом соответствии с требованиями Руководства Национального института здравоохранения по обращению с лабораторными животными и были утверждены Этическим комитетом по обращению с лабораторными животными компании Taiko Pharmaceutical.

Генератор газообразного ClO2

Генератор газообразного ClO2 был изготовлен в нашей лаборатории в соответствии с ранее приведенным описанием [9]. Генерация газа осуществлялась под тщательным контролем в целях поддержания постоянной концентрации газа в экспериментальной камере. Экспериментальная камера представляла собой ящик, изготовленный из прозрачного пластика размерами 90×120×45 (высота) см. В верхней части камере были проделаны пять отверстий диаметром 12 мм (рисунок 1) для отслеживания концентрации газообразного ClO2 внутри камеры. Концентрация газообразного ClO2 внутри камеры измерялась дважды в день при помощи трубки для отбора проб, которая вводилась в камеру через отверстие, и анализатора ClO2 (модели 4330-SP и 4330-1 производства компании Interscan Corportation, г. Сими-Вэлли, штат Калифорния). Осуществлялась постоянная вентиляция камеры со скоростью движения воздуха 32±1 м³/ч (n=9) с отсасыванием воздуха при помощи воздушного насоса. Чтобы добиться равномерной концентрации ClO2 внутри камеры был установлен цилиндрический (шириной 30 см и диаметром 6 см) электрический вентилятор с ламинарным потоком воздуха (модель MF930B-BC производства компании Oriental Motor, г. Токио, Япония).

Воздействие газообразного ClO2 на крыс

Крысы подвергались воздействию газообразного ClO2 в концентрации 1 ppm 5 часов в сутки, 5 дней в неделю в течение десятинедельного периода. Масса тела крыс измерялась дважды в неделю. На следующий день после завершения десятинедельного периода эксперимента крысы были анестезированы при помощи ингаляционного анестетика – простого эфира с использованием ветеринарного устройства для подачи наркоза (модель V1 производства компании VetEquip Inc., г. Плезантон, штат Калифорния) с применением кислорода в качестве газа-носителя. Затем у крыс была откачана кровь через брюшную аорту и извлечены внутренние органы. Извлеченные органы были сфотографированы, взвешены, визуально изучены и зафиксированы в растворе формальдегида 1,3 моль/л в фосфатном буфере 75 ммоль/л (pH 7,4). Зафиксированные в растворе формальдегида органы были затем помещены в парафиновый блок, нарезаны тонкими пластиками и окрашены гематоксилином и эозином или методом импрегнации серебром для исследования волокон коллагена и орсеином для исследования волокон эластина. Были получены бронхоальвеолярные смывы (BALF) извлеченного легкого путем введения 0,5 мл физиологического раствора с фосфатным буфером в левый бронх. Раствор вводился в бронх трижды, и был изготовлен мазок, содержащий 0,1 мл, для выполнения клеточного исследования. Гистологическое исследование органов и исследование BALF были выполнены и задокументированы одним лицом, а результаты были оценены по шкале от – до 5 +, в зависимости от уровня полученных показателей. Были выполнены биохимический и общий анализы крови.

Статистическое исследование

Различия в результатах исследования в обеих группах (в группе, контактировавшей с ClO2, в сравнении с животными, контактировавшими только с воздухом) были оценены с применением статистических методов при помощи двустороннего критерия Стьюдента t для параметрических данных и двустороннего критерия Манна-Уитни U для непараметрических данных. Различия считались существенными, если p <0,05.

Результаты

Концентрация газообразного ClO2

В ходе предварительного эксперимента мы обнаружили, что концентрация газообразного ClO2 существенно варьировала в различных точках экспериментальной камеры, невзирая на то, что скорость генерации газообразного ClO2 при помощи газогенератора [9] тщательно контролировалась и оставалась в высшей степени постоянной в течение длительного периода времени. Таким образом, оказалось, что концентрация газа в камере не была однородной во времени и в пространстве, несмотря на постоянное добавление газообразного ClO2 в камеру из газогенератора. Чтобы устранить этот недостаток мы установили электрический вентилятор с низким расходом и ламинарным потоком воздуха в каждой экспериментальной камере, с тем чтобы добиться равномерного распределения газа внутри камеры. Как и ожидалось, мы обнаружили абсолютно равномерную концентрацию газа в ряде точек камеры (рисунки 1 и 2, таблица 1) в течение длительного периода времени (рисунок 2). Концентрация газа через 1 час после начала воздействия газа на животных составляла 1,02±0,07 ppm (2,81±0.19 мг/м³, n=50; данные были получены в течение всего периода исследования), при измерении концентрации газообразного ClO2 в центре камеры (отверстие для отбора проб 5 на рисунке 1).


ClO2 generatorГенератор ClO2
fanвентилятор
exhaust pumpвытяжной насос

Рисунок 1: Экспериментальная установка для воздействия на крыс газообразным ClO2 или воздухом с использованием «экспериментальной камеры». Показаны вертикальная проекция (нижний рисунок) и боковая проекция (нижний рисунок) экспериментальной камеры для воздействия ClO2. Показаны отверстия для отбора проб газообразного ClO2, которым присвоены номера от 1 до 5. Экспериментальная камера «с воздухом» имеет такую же конструкцию, что и экспериментальная камера с ClO2, за тем исключением, что в первом случае отсутствует генератор ClO2.


Concentration, ppm (v/v)Концентрация, ppm (об.)
Time, dayВремя, сутки

Рисунок 2: Динамика концентрации газообразного ClO2 в экспериментальной камере с ClO2. Концентрация газообразного ClO2 измерялась ежедневно в центре экспериментальной камеры с ClO2 (отверстие для отбора проб 5 на рисунке) через 1 час (закрашенные кружки) и через 4 часа (незакрашенные кружки) после начала подачи газообразного ClO2 в экспериментальную камеру. Каждое отверстие соответствует одному замеру.

Отверстие для отбора проб ClO2
Измерение12345
Первое1,11,31,11,21,1
Второе1,21,21,11,21
Третье1,21,21,21,21,1

Таблица 1: Концентрация газообразного ClO2 в различных точках экспериментальной камеры с ClO2.
Концентрация газообразного ClO2 изменялась через 1 час после начала подачи газа в различных точках (отверстия для отбора проб) экспериментальной камеры, как показано на рисунке 1. Каждое значение соответствует концентрации газа в ppm (об.) в результате одного замера.

Масса тела и общее состояние животных

Масса тела самцов и самок крыс существенно не менялась независимо от того, контактировали они с газообразным ClO2 или с воздухом (рисунок 3). Общее состояние здоровья крыс в обеих группах (контактировавших с ClO2 или с воздухом), согласно визуальной оценке, было нормальным в течение всего периода исследования.


Body weight, gМасса тела, г
Time, dayВремя, сутки

Рисунок 3: Изменения веса тела крыс, контактировавших с газообразным ClO2 и с воздухом. Показаны самцы (A) и самки (B) крыс, которые подвергались воздействию ClO2 в концентрации 1 ppm (закрашенные кружки) или воздуха (незакрашенные кружки). Каждая точка соответствует среднему значению ± стандартное отклонение для восьми крыс.

Патологические изменения, обнаруженные при вскрытии

При вскрытии визуально исследованные органы (язык, глотка, гортань, трахея (как наружная, так и внутренняя поверхности), легкие, печень, почки, сердце, вилочковая железа, селезенка, желудок, тонкий и толстый кишечник, кишечные лимфатические узлы, яичники и матка) оказались нормальными в обеих группах (контактировавших с ClO2 и с воздухом) (данные не показаны). При этом имело незначительное спадение легкого у одного из самцов, контактировавшего с газообразным ClO2. Это, по всей видимости, не было связано с вдыханием газообразного ClO2, поскольку спадение легкого аналогичного размера было выявлено также и у одной из самок в контрольной группе. Спадение легкого периодически наблюдается у лабораторных крыс, и мы полагаем, что оно вызвано вдыханием частичек пыли, образовавшихся из корма животных. Масса извлеченных органов (легких, печени и почек) был практически одинаковой в обеих группах крыс (дополнительная таблица 1).

Общий и биохимический анализы крови

Результаты общего и биохимического анализов крови оказались в пределах нормы как в группе, контактировавшей с ClO2, так и в группе, контактировавшей с воздухом (дополнительные таблицы 2 и 3). Полученные результаты свидетельствуют о том, что вдыхание газообразного ClO2 не оказывает влияния на обмен веществ и на функции костного мозга у крыс.

Исследование BALF

Мазки BALF исследовались при помощи микроскопа (рисунок 4). Не было выявлено каких-либо статистически значимых различных, а именно p > 0,05, между группой, контактировавшими с ClO2, и группой, контактировавшей с воздухом, при анализе на степень выраженности изменений с применением критерия Манна-Уитни U (таблица 2). Это свидетельствует о том, что вдыхание газообразного ClO2 не оказывает влияние на дыхательный аппарат у крыс.


Рисунок 4: Микроскопические изображения клеток в бронхоальвеолярных смывах. Показаны репрезентативные клетки, полученные из бронхоальвеолярных смывов крысы-самки, контактировавшей с воздухом (слева) или с газообразным ClO2 в концентрации 1 ppm (справа), окрашенные раствором Гимза.

Воздействующее веществоПолКрысаКлетки столбчатого эпителияМакрофагоцитыНейтрофилыЛимфоциты
12+3+
2+4+
3+2+
ВоздухСамцы4+4++
5++
6+
7+
8+3++
92+4++
10+2++
11++
ВоздухСамки12+3++
13+2+
14+2+
15++
16+2+
17+4+
18+4+
192+5+
ClO2Самцы205+
21+2+
22+3++
23+
24+3+
25+
26+2+
27+2+
ClO2Самки28+3+
29+2+
302+
31+2++
32+2+

Степень выявленных воспалительных изменений варьировала в диапазоне от – до 5+ по наблюдениям одного исследователя. Различия между группой, контактировавшей с ClO2, и группой, контактировавшей с воздухом, оценивались с применением критерия Манна-Уитни U и оказались статистически несущественными.

Таблица 2: Анализ бронхоальвеолярных смывов (BALF), полученных после вскрытия крыс, контактировавших с ClO2 и с воздухом.

Воздействующее веществоПолКрысаВыделения из слизистой трахеиИнородные вещества в трахееВакуолизация клеток печениАктивизация лимфоцитов в печениРасширение внутрипеченочных желчных протоковВыделения из носовой полостиМакрофагоциты в легкихЛимфоциты в легких
1+++
2+++++
3+++
ВоздухСамцы4++++
52++++
6+++
7++++
8+++++
9+2+++
10+++++
11+++
ВоздухСамки122+2+++
13+++2++
14++++
15+++++2+
16+++++
17+2+2++
18++2+++
19+++
ClO2Самцы20++++
21+++
22++++2+
23++++2++
24+2+++
25++++
26+++
27++2++
28+2+++
ClO2Самки29++++++
30+++
31+++++
32+++++

Таблица 3: Гистологическое исследований органов крыс

Гистологическое исследование

Результаты гистологического исследования органов оказались в пределах нормы, и мы не выявили каких-либо статистически значимых различий (то есть p > 0,05) между группой, контактировавшей с ClO2, и группой, контактировавшей с воздухом, при анализе на степень выраженности изменений с применением критерия Манна-Уитни U (таблица 3). Глотка, трахея (рисунок 5), бронх, бронхиола и легкое (рисунок 6) оказались нормальными. Волокна коллагена и эластина, окрашенные с применением соответствующего красителя (см. выше), которые присутствовали в образцах тканей легкого, выглядели абсолютно нормальными (данные не показаны). У одной из крыс-самок, контактировавшей с газообразным ClO2, было отмечено расширение проксимального почечного канальца, однако это может быть не связано с воздействием газообразного ClO2, поскольку расширение проксимального почечного канальца периодически наблюдается у вида крыс, которые использовались в нашем эксперименте. В целом, мы пришли к выводу о том, что воздействие газообразного ClO2 в концентрации 1 ppm в описанных экспериментальных условиях не оказало токсичного влияния на крыс. Таким образом, NOAEL газообразного ClO2 для крыс составляет 1 ppm.


Рисунок 5: Микроскопические изображения трахей.
Показаны репрезентативные изображения трахей крысы-самца, контактировавшего с воздухом (слева) или с газообразным ClO2 в концентрации 1 ppm (справа), окрашенные гематоксилином и эозином.


Рисунок 6: Микроскопические изображения легких.
Показаны репрезентативные изображения легких крысы-самки, контактировавшей с воздухом (слева) или с газообразным ClO2 в концентрации 1 ppm (справа), окрашенные гематоксилином и эозином.

Обсуждение

Согласно Поле и Дебрусс, газообразный ClO2 в концентрации 1 ppm является токсичным для крыс: крысы Уистара (пол н указан) подвергались воздействию этого газа 5 часов в сутки, 5 дней в неделю в течение десятинедельного периода [7], как и в ходе настоящего исследования. Авторы отметили, что масса тела, число эритроцитов и лейкоцитов в периферической крови и паренхима печени и легких не изменились [7]. Мы получили аналогичные результаты в ходе настоящего исследования. С другой стороны, те же авторы отметили, что ими «было обнаружено полнокровие легочных кровеносных сосудов всех диаметров и незначительный интерстициальный отек слизистой оболочки трахеи и стенки бронха, без заметных изменений эпителия» [7]. Это наблюдение полностью противоречит полученным нами результатам (таблица 3). Мы не выявили полнокровия легочных кровеносных сосудов каких-либо диаметров. Мы также не наблюдали признаков интерстициального отека слизистой оболочки трахеи и бронхов. Причина подробных расхождений в результатах исследований неизвестна.

Мы полагаем, что эта разница может быть связана с колебаниями концентрации газообразного ClO2, воздействию которого подвергались крысы. Поле и Дебрусс не приводят подробного описания использованной им системы генерации ClO2 и способа измерения концентрации газообразного ClO2 в использованном ими экспериментальном устройстве, которое не было подробно описано в работе [7]. Кроме того, в отчете об их исследовании отсутствуют данные фактических замеров концентрации газа. Как следствие, остается неясным, насколько точно они поддерживали концентрацию в 1 ppm в течение всего периода эксперимента. Как указано выше, мы изначально столкнулись с трудностями при попытке обеспечить равномерную концентрацию газообразного ClO2 в экспериментальной камере. Кроме того, оказалось довольно сложным изготовить генератор газообразного ClO2, который был бы способен генерировать ClO2 с постоянной скоростью потока, до тех пор, пока мы не разработали в нашей лаборатории более совершенное устройство [9]. С его помощью была обеспечена очень стабильная генерация газообразного ClO2 в течение длительного периода времени. Как следствие, мы не можем дать подробную оценку данным вышеупомянутых авторов. Мы повторили их эксперимент с максимальной точностью, воспроизведя их экспериментальные условия, чтобы иметь возможность строго оценить полученные ими данные. Как следует из результатов нашего исследования, мы не смогли воспроизвести их данные. Таким образом, мы можем предположить, что LOAEL в 1 ppm, которую установили Поле и Дебрусс [7], следует интерпретировать как NOAEL.

Благодарности

Авторы выражают свою признательность Хирофуми Морино, Кимико Итаяме и Айюми Сахода за оказанную ими помощь.

References

  1. Neumann G, Chen H, Gao GF, Shu Y, Kawaoka Y (2010) H5N1 influenza viruses: outbreaks and biological properties. Cell Res 20: 51-61.
  2. Ogata N, Shibata T (2008) Protective effect of low-concentration chlorine dioxide gas against influenza A virus infection. J Gen Virol 89: 60-67.
  3. Ogata N (2012) Inactivation of influenza virus haemagglutinin by chlorine dioxide: oxidation of the conserved tryptophan 153 residue in the receptor-binding site. J Gen Virol 93: 2558-2563.
  4. Ogata N (2007) Denaturation of protein by chlorine dioxide: oxidative modification of tryptophan and tyrosine residues. Biochemistry 46: 4898-4911.
  5. DALHAMN T (1957) Chlorine dioxide toxicity in animal experiments and industrial risks. AMA Arch Ind Health 15: 101-107.
  6. Paulet G, Desbrousses S (1970) [Effect of a weak concentration of chlorine dioxide on laboratory animals]. Arch Mai Prof 31: 97-106.
  7. Paulet G, Desbrousses S (1972) [Toxicology of chlorite]. Arch Mai Prof 33: 59-61.
  8. Paulet G, Desbrousses S (1974) Effects of chlorine dioxide on the rat during discontinuous exposure. Arch Mai Prof 35: 797-804.
  9. Akamatsu A, Lee C, Morino H, Miura T, Ogata N, et al. (2012) Six-month low level chlorine dioxide gas inhalation toxicity study with two-week recovery period in rats. J Occup Med Toxicol 7: 2.
16 апреля 2013 г.
Комментарии (видны только специалистам, верифицированным редакцией МЕДИ РУ)
Если Вы медицинский специалист, войдите или зарегистрируйтесь

МЕДИ РУ в: МЕДИ РУ на YouTube МЕДИ РУ в Twitter МЕДИ РУ на FaceBook МЕДИ РУ вКонтакте Яндекс.Метрика