Онколитический вирус болезни Ньюкасла и аутологичные опухолевые клетки в комплексной терапии рака
Статьи Опубликовано в журнале "Эпидемиология и вакцинопрофилактика № 3(34)/2007 стр. 23-28В.В. Кешелава
лауреат государственной премии, д.м.н.
руководитель отделения онкопатологии ФГУ «РНЦРР» Росздрава, г. Москва Oncolytic Newcastle disease virus and tumor cells in complex cancer therapy
Keshelava V.V.
Federal State Enterprise “Russian Scientific Center of Roentgenoradiology of Russian Health and Social Development Ministry”.
Abstract
The progress in oncological diseases treatment is due to significant achievements of molecular biology, immunology and development of immunotherapy methodology. One of the most perspective methods is known to be antitumor vaccination with vaccines containing intact tumor cells (autologic and allogenic), autologic hit shock proteins, Newcastle disease virus (NDV).
Antitumor vaccines generation methods and their role in cancer prophylaxis and treatment has been worked out and recognized. Wide experience of these vaccines usage has been collected by clinical oncologists and their effectiveness has been recognized by many clinics over the world.
Autologic vaccine consists of tumor cells exposed during the tumor extraction.
The interclinical prospective nonrandomized research of vaccines’ effectiveness and toxicity held in 2004–2006 included 46 patients with skin melanoma (9 patients), breast cancer (21 patient), large intestine cancer (7 patients), cervix cancer (5 patients), ovarian cancer (1 patient), uveal melanoma (2 patients), vagina cancer (1 patient). Medium age of the patients was 54,2.The majority of patients suffered disseminated tumor process with multiple metastasis affecting several organs and resistant to radial and chemotherapy. Almost all patients were treated on an outpatient basis. So they were leading their common life during the treatment. There were no complications noticed. At the end of the first course of treatment pain and metastasis were reduced, the patients rejected narcotics and anaesthetics, became active, their appetites and weight improved. Due to low toxicity it became possible to continue treatment up to one year and even longer to get stable results.
За последние годы в онкологии сделано много, но решающего прорыва не произошло. Все чаще в отечественной и зарубежной литературе появляются сообщения несколько сенсационного плана, свидетельствующие о переломном моменте в лечении больных раком. Прогресс в лечении онкологических заболеваний связан с существенным прорывом в молекулярной биологии, иммунологии, развитии методов иммунотерапии, из которых наиболее перспективным представляется создание противоопухолевых вакцин: на основе цельных опухолевых клеток (аутологичных и аллогенных); ДНК или РНК – вакцины; рекомбинантные вирусные или бактериальные вакцины; вакцины на основе аутологичных белков теплового шока и др. (1,2,7.8).
Клиническая онкология имеет большой опыт использования противоопухолевых вакцин эффективность применения которых доказана во многих клиниках мира. При этом разработаны и общепризнанны методы получения противоопухолевых вакцин и определено их место в профилактике и лечении рака (2.3.5.7.8.).
Клетки собственных опухолей, полученные при операции или биопсии, широко используются в мировой онкологической практике для получения иммунотерапевтических препаратов для того же самого пациента. Основной задачей при такой терапии является повышение иммуногенности собственных опухолевых клеток с помощью химической обработки - гаптенизации, генетической модификации - трансфекцией генов кодирующих стимулирующие иммунитет молекулы и вирусной модификации. Последний подход является наиболее технологичным при использовании вируса селективно заражающего опухолевые клетки. Таковым является вирус болезни Ньюкасла (ВБН) - псевдочумы птиц, точнее его вакцинные штаммы – генетически стабильные, апатогенные для млекопитающих, живые вирусные препараты, повсеместно используемые для профилактики заболевания у кур. Преимущественное размножение этого вируса в опухолевых клетках млекопитающих было продемонстрировано более 40 лет назад. С этого времени большим количеством экспериментов на опухолях животных доказана безвредность ВБН для млекопитающих и его достаточно высокая терапевтическая эффективность, особенно в случае сочетания онколитического действия с иммунизирующим воздействием зараженных вирусом опухолевых клеток
Существует множество различных штаммов ВБН, все они классифицированы как литические (лизирующие клетки: МТН-68,73-Т, Roakin, PV701) и нелитические (Ульстер) для человеческих клеток и изучались как противораковые агенты(4-8).
Исследователи при этом предполагают три клеточных механизма взаимодействия. Первый механизм – литические штаммы вируса напрямую уничтожают опухоли. Второй – с помощью нелитических штаммов белки вируса проникают в мембрану опухолевых клеток, вызывая иммунную реакцию. И, наконец, сам вирус может стимулировать организм носителя вырабатывать цитокины: интерфероны и фактор некроза опухоли (TNF), что ведет в свою очередь к активации естественных клеток-убийц, макрофагов и сенсибилизированных Т-клеток.
Вместе с тем есть много вопросов в клеточном механизме взаимодействия вируса с организмом. Не совсем ясно, какой из штаммов более эффективен, а также что эффективнее - собственные опухолевые клетки пациента или опухолевые клеточные линии.
Экспериментальные исследования на животных показали, что ВБН и зараженные ВБН раковые клетки могут стимулировать большое разнообразие иммунных ответов, что способствует успешной терапии рака. Доказано - ВБН безопасен, лечение считается безвредным. Эффективность метода в той или иной мере подтверждена клиническими наблюдениями на пациентах с различными злокачественными новообразованиями (II – III фазы испытаний) проведенными в США, Европе и Китае. Представлены результаты исследований использования онколизатов (штамм ВБН 73-Т для лечения метастатической меланомы, а так же рака почки, молочной железы и яичников), цельноклеточных вакцин (штамм ВБН Ульстер для лечения колоректального рака, рака яичников почки, шейки матки) и заражение пациентов литическим штаммом ВБН МТН-68 для лечения рака толстой кишки, желудка, поджелудочной железы, легких и др. (6.7.8)
Во всех случаях отмечен положительный эффект применения, как чисто вирусной терапии, так и аутологичной вакцинации вирус модифицированными опухолевыми клетками. Некоторые противоопухолевые вакцины в настоящее время завершают III фазу клинических испытаний и по мнению большинства исследователей уже в недалеком будущем активная иммунотерапия станет стандартным методом и частью комплексного лечения рака (4-8).
Нами проанализированы результаты и возможности вакцинотерапии большинства клиник, обобщен опыт работы общепризнанных специалистов и с 2003 года начаты экспериментальные и клинические исследования по данной проблеме в рамках допустимых и принятых медицинских программ с учетом мирового опыта в процессе клинических испытаний, в том числе и России.
Была поставлена задача оптимизации и совершенствования имеющихся технологий получения аутологичных и модифицированных ВБН вакцин, а также онколитического ВБН для использования у пациентов с различными злокачественными заболеваниями.
Применяемый нами вирус Болезни Ньюкасла, живая вакцина для птицеводства, апатогеный штамм Ла-Сота выращивается в свободных от патогенной микрофлоры куриных эмбрионах. Для внесения в человеческие опухолевые клетки и для инъекций пациентам вирус очищали ультрацентрифугированием и проверяли на стерильность и безвредность. Оценка токсичности препарата (вакцины) проводилась в соответствии с критериями, рекомендованными ВОЗ. Препарат при необходимости может быть лиофилизован, сохраняя при этом свои свойства в течение одного года.
Для приготовления аутологичной вакцины используют опухолевые клетки, выделенные непосредственно в ходе удаления опухоли. Технология приготовления вакцины общеизвестна и предполагает дезагрегацию образцов опухоли, культивирование клеток, облучение клеток с целью блокады их пролиферативной активности и различные приемы модификации с целью повышения ее эффективности. Этап создания культуры опухолевых клеток представляет собой сложный и неоднозначный процесс. По мнению абсолютного большинства исследователей, существуют значительные трудности и особенности в создании условий, благоприятных для индивидуальных первичных культур опухолевых клеток. Выживание клеток и их пролиферация возможны только лишь при воссоздании всех внешних условий, которые клетки имели in vivo. Разработанные и применяемые нами оригинальные технологии выделения и культивирования клеток позволяют получить пролиферирующие первичные культуры более чем 70% случаев для таких опухолей как меланома кожи, рак почки, толстой кишки, яичников и молочной железы, а клеточные линии – не менее чем в 50% случаев.
Не менее специфичным в процессе приготовления клеточных вакцин является необходимость инактивировать их способность к размножению с одновременным сохранением их метаболической активности и повышения иммуногенности собственных опухолевых клеток с помощью вирусной модификации. На данном этапе клетки инактивировали гамма-излучением (дозы облучения подбирали индивидуально), замораживали в жидком азоте и использовали для вакцинации в дозах 10 – 50 млн. после обработки 10 - 100 ID50 вируса (ВБН) на клетку.
Более специфическую аутовакцину получали из размножающихся in vitro клетках – перевиваемых опухолевых линиях. Такие линии могут быть получены из операционного или биопсийного материала и могут размножаться бесконечно долго, обеспечивая необходимое для вакцинации количество гомогенных опухолевых клеток. Эти линии также замораживали, инактивировали гамма-излучением и обрабатывали вирусом перед введением пациентам.
Известно, принцип действия противоопухолевых вакцин основан на усилении противоопухолевой защиты, заложенной в природе иммунитета здорового человека. Недостаточность противоопухолевого иммунитета обусловлена растущей опухолью и/или прогрессированием с возникновением множества метастазов и иммунодепрессивным эффектом противоопухолевой химиотерапии и облучения.
Усиление эффективности противоопухолевых вакцин путем повышения иммуногенности опухолевых антигенов нами достигалась модификацией вакцины непатогенным вирусом (ВБН) и использованием человеческого рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ). Основное биологическое действие Г-КСФ – гемопоэтическое, главным образом нейтрофилопоэтическое. Его введение в организм приводит к увеличению содержания в крови функционально активных нейтрофилов. Кроме этого препарат повышает биохимическую (синтез протеаз), фагоцитарную, хемотаксическую активности, усиливает в организме синтез других цитокинов (интерферонов, трансформирующего фактора роста β и др.). Тем самым активизируются различные неспецифические и специфические механизмы защиты организма.
Предварительная клиническая и иммунологическая оценка эффективности вакцинотерапии в сочетании с Г-КСФ, а так же наличие клеточных линий полученных на этапах создании позволили пересмотреть принципы и подходы химиотерапии в данном комплексе лечения. Правильный подбор препаратов избирательно действующих на опухолевые клетки, выбор оптимальной дозы, режима и способа применения позволяли проводить курсы химиотерапии длительно без каких-либо осложнений в течение всего курса вакцинотерапии.
Предполагая данную комплексную методику лечения рака, мы учитывали те слабые сторон аутовакцин, где результат зависит от индивидуальных особенностей противоопухолевого иммунитета, а опухоль характеризуется не только множественностью антигенов, но и повышенной мутационной активностью с дальнейшим усилением признаков злокачественности.
Проведенные медико-биологические исследования показали высокую эффективность предлагаемой модели патогенетической терапии и позволили с учетом в рамках допустимых и принятых медицинских программ провести клинические испытания на определенной группе больных с различными злокачественными новообразованиями.
Цель данного исследования: оценить объективный непосредственный эффект и его продолжительность, время до прогрессирования, выживаемость, качество жизни больных с различными злокачественными заболеваниями при использовании как аутологичных, облученных вакцин модифицированных ВБН (группа А), так и получивших онколитический вирус ВБН в чистом виде (группа В) в плане комплексного лечения.
Для отбора больных были использованы общепринятые в клинической практике критерии.
Критерии включения:
- Гистологически верифицированный диагноз опухолевого очага
- Возраст старше 18 лет
- Общее удовлетворительное состояние (индекс Карновского не менее 70%)
- Отсутствие противоопухолевого эффекта лечения на фоне ранее проводимого лечения или наличие признаков прогрессирования после их проведения.
- Возможность визуальной или инструментальной оценки динамики изменений
- Согласие больного на участие в данном исследовании.
- Поражение центральной нервной системы
- Активный аутоиммунный процесс
- Возраст старше 70 лет
- Больные с одной из перечисленных инфекций: HIV, HBV, HCV.
- Наличие инфекционных или тяжелых заболеваний сердечно-сосудистой, нервной, дыхательной или эндокринной систем; беременность или лактация
- Нарушение функции печени и/или почек (билирубин >1,5хN, креатинин >1,5хN), показатели крови: лейкоциты 9 /Л, Hb <90 г/л, лимфоциты 9 /Л, тромбоциты 9 /Л.
За период 2004-2006 годы в межклиническое проспективное нерандомизированное исследование эффективности и токсичности используемых вакцин было включено 46 больных из них: 9 - меланома кожи , 21 - рак молочной железы, 7 - рак толстой кишки, 5 - рак шейки матки, 1 - рак яичников, 2 больных с увеальной меланомой и 1 больная меланомой влагалища. Средний возраст пациентов составил 54,2 года.
В обоих исследованиях больным вакцину в сочетании с Г-КСФ под/внутрикожно вводили раз в неделю в течение 4х недель, начиная с 4 по 8 недели после операции. В последующем курс продолжали аналогичными инъекциями раз в две недели в течение 1 года, далее уколы делали с возрастающим до 3х месяцев интервалом на протяжении 1,5 лет.
При проведении комбинированного лечения с включением курсов адьювантной химиотерапии и при показаниях лучевой терапии в течении 6 месяцев лечения 29 больных получили аутологичную, облученную вакцину, модифицированную ВБН от 8 до 16 внутрикожных введений, а 17 больных - онколитический вирус болезни Ньюкасла до 16 внутрикожных введений также при 6 месячном курсе лечения.
Необходимо учитывать тот факт, что большинство больных имели диссеминированные формы опухолей резистентные к лучевой и химиотерапии при наличии растущих множественных метастазов поражающих не один орган.
Следует отметить, что всем больным (46) проведен полный курс комплексной терапии рака и в последующем проводился курс поддерживающей вакцинотерапии течении 9 месяцев и более амбулаторно. В настоящее время все больные находятся в процессе лечебной или профилактической вакцинотерапии и динамического наблюдения с мониторингом основных жизненных параметров.
Результаты клинических исследований эффективности использования аутологичной, облученной и модифицированных вирусом болезни Ньюкасла вакцины (группа А) и использования онколитического вируса болезни Ньюкасла в чистом виде (группа В) представлены в таблице 1 и 2.
Таблица 1. (группа А)
Результаты клинических исследований эффективности использования аутологичной, облученной и модифицированных вирусом болезни Ньюкасла вакцины.
| Локализация/стадия | Количество больных | Лечебный эффект * | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| ПО | ЧО | СТ | ПР | |||
| Меланома кожи | Т1-4 N 1-2 M 1 | 7 | - | 2 | 5 | - |
| Меланома влагалища | Т4 N 2 M0 | 1 | 1 | |||
| Увеальная меланома | Т3-4N 1-2 M 1 | 2 | - | - | 2 | - |
| Рак молочной железы | Т1-4 N 1-3 M0-1 | 13 | 2 | 6 | 4 | 1 |
| Рак толстой кишки | Т3-4 N 1-2 M 1 | 5 | 2 | 2 | 1 | - |
| Рак яичников | Т1с N 0 M 1 | 1 | - | - | 1 | - |
| ВСЕГО: | 29 | 5 | 10 | 13 | 1 | |
Таблица 2. (группа В)
Результаты клинических исследований эффективности использования онколитического вируса болезни Ньюкасла.
| Локализация/стадия | Количество больных | Лечебный эффект * | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| ПО | ЧО | СТ | ПР | |||
| Меланома кожи | Т3 N 1 M 1 | 2 | - | - | 2 | - |
| Рак молочной железы | Т2-4 N 1-3 M0- 1 | 8 | - | 1 | 7 | - |
| Рак толстой кишки | Т4 N 1 M 1 | 2 | - | - | 2 | - |
| Рак шейки матки | Т1-3 N х M0 | 5 | 2 | - | 3 | - |
| ВСЕГО: | 17 | 2 | 1 | 14 | 0 | |
(ПО) - полный ответ: исчезновение всех опухолевых очагов на срок не менее 4 недель.
(ЧО) - частичный ответ: уменьшение измеряемых очагов на 30% и более
(ПГ) - прогрессирование: увеличение на 20% наименьшей суммы очагов поражения, зарегистрированной за время наблюдения, или появление нового опухолевого очага.
(СТ) - стабилизация: нет уменьшения, достаточного для оценки как частичного эффекта, или увеличения, которое можно оценить как прогрессирование.
Клинические и лабораторные исследования в обеих группах показали, что методы вакцинотерапии нетоксичны, хорошо переносились больными и сопровождались иммунологическим ответом у 42 больных, что подтверждено показателями периферической крови.
Большинство пациентов проходили курсы лечения амбулаторно. В течение всего процесса лечения больные вели произвольный образ жизни. Каких-либо осложнений в процессе комплексного лечения не было отмечено. При завершении 1-го курса лечения исчезала боль, уменьшались метастазы, больные отказывались от наркотических и обезболивающих средств, становились активнее, у них повышался аппетит, и они прибавляли в весе. Отсутствие токсичности делало возможным применение данного метода лечения в течение года и более, до получения стойкого эффекта.
Результаты клинических исследований эффективности использования вирусной терапии опухолей с помощью ВБН и аутологичной иммунотерапии клетками, модифицированными этим вирусом в комплексной терапии рака в группах А и В (табл. 1,2) показали следующее: лихорадка I и II степени наблюдалась практически у всех больных, сопровождалась кратковременным ухудшением самочувствия, не требовала какого-либо лечения и в течение суток самостоятельно купировалась. Локальные кожные реакции в месте введения вакцины, как при первичном, так и при повторных ее введениях: гиперемия и локальный отек в месте введения стихали в течение нескольких дней после вакцинации и не требовали дополнительного лечения. Подобные симптомы, как правило, традиционно наблюдаются при вакцинации разных типов. Возможные побочные эффекты при повторных вакцинациях в течение 4-5 суток после вакцинации вследствие выработки специфических антител в виде лихорадки, озноба, ощущения жара, кожной сыпи, увеличения некоторых групп лимфатических узлов ни в одном из случаев не были зарегистрированы.
Полный ответ: исчезновение всех опухолевых очагов получен у 7 больных (15.2%). Из которых (табл. 1 группа А) 5 (17.2%) больных: рак: молочной железы (2) и толстой кишки (2), 1 больная меланомой влагалища, и 2 (11.7%) больных с распространенным раком шейки матки (табл. 2 группа В). Полный регресс подтвержден данными морфологических исследований (контрольная биопсия из раннее пораженных участков шейки матки и влагалища) и клиническими наблюдениями включающих компьютерную и магнитно-резонансную томографию, радионуклидные и иммунологические показатели. Тенденция к уменьшению количества и размеров метастазов в печени, легких, костях и в лимфатических узлах намечалась после второго курса комплексного лечения, и завершалась полным их исчезновением на 5-6 курсе терапии. Средняя продолжительность эффекта составляет 8 месяцев (от 4 до 16 мес.).
Частичный ответ: уменьшение измеряемых очагов на 30 % и более наблюдался у 11 больных (23.9 %). Это согласно табл. 1 группа А 10 (34.5%) больных из них: 2 меланома кожи, 6 – рак молочной железы и 2 – рак толстой кишки. В группе В (табл. 2) частичный регресс получен у 1 (5.7%) больной раком молочной железы. Средняя продолжительность эффекта в обеих группах больных составляет 7,7 месяцев.
Стабилизация опухолевого процесса: нет уменьшения, достаточного для оценки как частичного эффекта, или увеличения, которое можно оценить, как прогрессирование наблюдалась у 27 больных (58.7%). Это согласно табл.1 группа А 12 (41.3%) больных: меланома кожи (5), рак: молочной железы (4), яичников (1), толстой кишки (1) и увеальной меланомой(2). Средняя продолжительность эффекта у данной группы больных составляет 7,7 месяцев.
В группе В (табл. 2) стабилизация опухолевого процесса отмечена у 14 (82.3%) больных: меланома кожи (2), рак: молочной железы (7), толстой кишки(2) и шейки матки (3). Средняя продолжительность эффекта в данной группе – 6 месяцев.
Прогрессирование: увеличение на 20% наименьшей суммы очагов поражения, зарегистрированной за время наблюдения, или появление нового опухолевого очага наблюдалось и у 2 больных (6.8%) в группе А: рак молочной железы и меланома кожи.
В таблице 3 суммированы критерии лечебного эффекта комплексной терапии больных со злокачественными опухолями в группах А и В.
Табл.3. Критерии лечебного эффекта использования аутологичной, облученной и модифицированных ВБН вакцины (группа А) и онколитического ВБН (группа В) в комплексной терапии рака.
| Критерии эффекта по шкале RECIST | Группа А: n*=29 больные / % | Группа В: n*=17 больные / % |
|---|---|---|
| Полный ответ | 5 / 17.2 % | 2 / 11.7 % |
| Частичный ответ | 10 / 34.5 % | 1 / 5.7 % |
| Стабилизация | 12 / 41.3 % | 14 / 82.3 % |
| Прогрессирование | 2 / 6.8 % | 0 / 0 % |
Анализируя предварительные результаты комплексной терапии рака по данным приведенные в таблице 3 можно сделать следующие выводы:
- вирус болезни Ньюкасла (апатогеный штамм Ла-Сота) по уровню эффективности и безопасности применения соответствует признанным стандартам специфической иммунотерапии опухолей.
- вакцинотерапия применима в качестве иммунологического адъюванта в комплексной терапии для лечения больных диссеминированными солидными опухолями.
- вирусная терапии опухолей с помощью ВБН и аутологичной иммунотерапии клетками, модифицированными этим вирусом нивелируя иммунодепрессивный эффект противоопухолевой химиотерапии и облучения позволяет проводить комплексную терапию длительно и с эффектом без каких-либо осложнений в течение всего курса лечения.
- вакцины на основе опухолевых клеток, модифицированных ВБН способны инициировать более выраженный специфический противоопухолевый (терапевтический) эффект в сравнении с онколитическим ВБН в чистом виде в комплексной терапии рака, что делает метод лечения при возможности использования предпочтительным.
Анализ предварительных полученных результатов на небольшом клиническом материале и малые сроки наблюдения за больными не позволяют найти ответы на множество актуальных вопросов. В какой степени видимый клинический успех можно отнести к вакцинации опухолевыми клетками, зараженными ВБН или к чисто вирусной терапии у больных получивших комплексное лечение. Вероятно, пройдет еще немало лет до начала применения программы по вакцинотерапии в клинической практике. Однако систематизация огромного информационного потока, результатов клинических и экспериментальных работ ученых в различных странах мира позволяют рассчитывать на доминирующую роль иммунотерапевтических препаратов в лечении онкологических заболеваний.
И уже в недалеком будущем активная иммунотерапия станет стандартным методом и частью комплексного лечения рака.
Применение вирусной терапии опухолей с помощью ВБН и аутологичной иммунотерапии клетками, модифицированными этим вирусом в комплексном лечении рака, может быть реально осуществлено на базе медицинских центров. Экспериментальное производство препарата отработано и не требует больших затрат. Области и схемы применения ВБН в онкологических клиниках могут быть отработаны, с учетом мирового опыта, в процессе клинических испытаний.
Результаты клинических испытаний показали, что все виды клеточных вакцин обладают определенным иммунологическим и клиническим эффектом. Объективный непосредственный эффект и его продолжительность, время до прогрессирования, выживаемость, качество жизни больных при использовании вакцин показали повышение качества и улучшение перспективы лечения онкологических больных, что позволяет рассчитывать на доминирующую роль данного метода в процессе лечения. Перспективным так же представляется проведение иммунотерапии вакцинами у больных после радикального лечения или циторедуктивных операций с минимальным объемом опухолевой массы.
Вместе с тем следует отметить, что, хотя перспективность использования противоопухолевых вакцин в онкологии можно считать установленной, их внедрение в клиническую практику ограничивается высокой стоимостью, а также довольно сложной технологией изготовления, требующей высококвалифицированного персонала и соответствующего оснащения. Можно надеяться, что создание специализированных лабораторий клеточной медицины, разработка новых методов и совершенствование существующих технологий получения противоопухолевых вакцин позволят уже в ближайшее время использовать их в качестве доступного метода лечения широкого круга онкологических больных.
Список использованной литературы
