Отчет о токсикологическом изучении препарата ЛИВ52
СтатьиРоссийский кардиологический научно-производственный комплекс министерства здравоохранения РФ
Научно-исследовательский институт экспериментальной кардиологии
Лаборатория лекарственной токсикологии
Руководитель - доктор медицинских наук, профессор Е. В. Арзамасцев
Москва - 2001
Исследование мутагенности препарата "ЛИВ52" проведено в лаборатории лекарственной токсикологии НИИ экспериментальной кардиологии Российского кардиологического научно-производственного комплекса Министерства здравоохранения России, руководитель лаборатории - профессор Е.В. Арзамасцев.
Руководитель исследований - доктор медицинских наук, профессор Е В. Арзамасцев.
Ответственный исполнитель - ведущий научный сотрудник; кандидат биологических наук К. И. Малиновская.
Исполнители:
научный сотрудник, кандидат биологических наук С. И. Поликарпова, научный сотрудник Е.Л. Левицкая, младший научный сотрудник Е.В. Тихонова.
Исследуемое вещество: "ЛИВ 52", субстанция.
Спонсор: Трансатлантик интернэйшнл ПТЕ. ЛТД. Россия, Москва 107078 Орликов пер. дом 10.
Системы исследования:
1.Тест Эймса.
2. Исследование индукции доминантных летальных мутаций у мышей.
3. Влияние на систему репарации ДНК в SOS-хромотесте.
Исследование мутагенности препарата "ЛИВ52" было проведено в соответствии с требованиями Фармакологического комитета МЗ РФ.
1.1. Изучение мутагенных свойств препарата "ЛИВ52" на микроорганизмах в тесте Эймса.
Оборудование, используемое при проведении теста Эймса:
| Название | Фирма | Страна-производитель |
| Becы лабораторные | Sartorius GMBH Gottingen | Germany |
| Микропипетки Finnpipette Gigital от 5 до 5000 мкл | Labsystems | Finland |
| Vortex-2 Genie | Scientific industries, Inc. | USA |
| магнитная мешалка Framo-Geratetechnik | Franz Moral Laakintasahko | - |
| Instrutemp (водяная баня с термостатом) | Instrumentarium | Finland |
| Автоклав -46Е | Finn-Aqua Santasalo-sohlberg AB. | Finland |
| Стерилизатор на горячем воздухе 4-14 М | Finn-Aqua Santasalo-sohlberg AB. | Finland |
| Ламинарный шкаф | BABCOCK-BSH. Laminar-Flow | Germany |
| Счетчик для подсчета колоний | Nsw Brunswick scientific | USA |
| Термостат | Labortechnik | GDR |
| СВЧ-печка | Samsung | Korea |
Список химических реактивов и расходных материалов, используемых в тесте Эймса.
| Химические реактивы и расходный пластик | Фирма | Страна - производитель |
| Питательный бульон № 2 | "Oxoid" | England |
| Дрожжевой экстракт Bacto | "Difco" | USA . |
| Bacto - агар | "Difco" | USA |
| D (+)-Глюкоза (моногидрат) | "MERCK" | Germany |
| MgSО4 х 7H2О | "MERCK" | Germany |
| Лимонная кислота (C6H8O7) | "SERVA" | USA |
| К2НРО4 х 3H2O | "Диa - M" | Россия |
| NaNH4HPO4 х 4H2О | "MERCK" | Germany |
| NaCl | "MERCK" | Germany |
| L-Гистидин | "MERCK" | Germany |
| d - Биотин (Витамин H) | "SIGMA" | USA |
| KCI | "Fluka" | Switzerland |
| Глюкозо-6-фосфат | "Reanal" | Hungary |
| НАДФ (C21H27N7О17P3Na) | "Reana!" | Hungary |
| Трис-(гидроксиметил)-аминометан | "Fluka" | Switzerland |
| Тризма гидрохлорид (Трис-(гидроксиметил)-аминометан гидрохлорид) | "SIGMA" | USA |
| МgСl2 x 6Н2О | "MERCK" | Germany |
| Наконечники для пипеток, пластиковые, стерильные, одноразовые | Labsystems | Finland |
| Чашки Петри, пластиковые, стерильные, одноразовые | - | - |
| Совол | - | Россия |
| 9-Аминоакридин | "SIGMA" | USA |
| 4-Нитрохинолин-N-оксид | "SIGMA" | USA |
| 2-Аминоантрацен | Serva | USA |
| Глицерин | "Fluka" | Switzerland |
Дата проведения теста Эймса: 10-13 июля 2001 г.
Оценка мутагенной активности препарата "ЛИВ52" проведена методом учета способности соединения индуцировать генные мутации у индикаторных микроорганизмов в системе метаболической активации in vitro и без системы метаболической активации. Использован чашечный метод учета мутаций, предложенный Ames et al. (1972,1984) в модификации, описанной в "Руководстве по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ" (Москва,2000), рекомендованном Фармакологическим государственным комитетом МЗ России по тестированию препаратов на стадии их доклинического токсикологического изучения.
В качестве индикаторных микроорганизмов использовали ауксотрофные по гистидину штаммы Saimonella typhimurium TA98, ТА100, ТА1537. О наличии мутагенного действия препарата судили по индукции обратных мутаций от ауксотрофности по гистидину к прототрофности.
Штамм TA98 несет мутацию his D3052, фреймшифт мутацию типа -1. Реверсия к дикому типу происходит за счет делеции
| Ц-Г |
| Г-Ц |
| Ц-Г-Ц-Г-Ц-Г-Ц-Г |
| Г-Ц-Г-Ц-Г-Ц-Г-Ц, |
Мутация his D3052 использована в тесторном штамме для доказательства способности изучаемого вещества индуцировать мутации типа сдвига рамки считывания. В качестве позитивного контроля на мутацию his D3052 использовали 4-нитрохинолин-N-оксид (4-НХО).
Мутация, his C3076 - это мутация сдвига рамки считывания штамма ТА1537. Последовательность ДНК мутанта his C3076 не определена, однако известно, что она содержит один добавленный цитозин к ряду из трех цитозинов и супрессируется супрессором suf В. Как позитивный контроль на мутацию his C3076 использовали 9-аминоакридин (9-АА).
Штамм ТА100 несет мутацию his G46, миссенс-мутацию, ревертирующую под действием многих мутагенов, индуцирующих замены пар оснований. В качестве положительного контроля на эту мутацию применяли азид натрия.
Метод позволяет изучить как прямое действие исследуемого вещества на тесторные штаммы, так и действие его метаболитов, образующихся под влиянием микросомальной фракции индуцированной печени крысы.
Перед работой штаммы были проверены на ауксотрофность к гистидину, на наличие у штаммов TA98 и ТА100 плазмиды рКМ 101 и наличие мутации rfa.
Для проведения теста Эймса препарат "ЛИВ52" получали следующим образом: приготавливали взвесь 10 мг полученного от производителя стерильного препарата в 1 мл стерильного 50% раствора глицерина, дальнейшие разведения готовили на глицерине и вносили на чашки Петри. Исследовали концентрации препарата от 0,1 до 1000 мкг/ чашку.
Селективный полуобогащенный агар в пробирках в объеме 2 мл плавили в СВЧ-печке, охлаждали в термостатируемой водяной бане до температуры 44-45°С. В пробирки с агаром вносили 100 мкл взвеси препарата, 100 мкл суспензии ночной культуры бактерий, 100 мкл фракции S9 печени крысы и кофакторы. Микросомальную фракцию печени крысы, индуцированной Арохлором, получали в виде лиофилизата у фирмы Labsystems, Финляндия. Проводили опыт как с полной микросомальной активирующей смесью, ПАМС, так и с неполной активирующей микросомальной смесью, НАМС.
Указанные смеси вносили в пробирки после извлечения их из термостатирующей бани и тут же наносили полужидкий агар на слой минимального агара на чашках Петри. После полного застывания агара чашки переносили в термостат при 37°С. На каждую дозу препарата делали 3 повторности с ПАМС и 3 повторности с НАМС. Через 48 часов инкубации при 37°С производили учет прототрофных ревертантов.
Оценку результатов проводили по алгоритму, приведенному в "Методических рекомендациях". Для каждого варианта рассчитывали среднее геометрическое число ревертантов с определением
| _________ | |
| Хi=3√ | xi1*xi2*xi3 |
где Xi - число ревертантов в чашках Петри 1,2,3 на дозе i.
Для каждого опытного варианта находили кратность превышения среднего геометрического числа ревертантов в опыте над контролем и сравнивали с критическим значением, приведенным в "Методических рекомендациях" (1,9 для штамма ТА1537 и 1,5 для штаммов ТА98 и ТА100).
Как видно из данных, представленных в Таблице 1, бактериальные штаммы увеличивали число ревертантов под действием веществ, взятых в качестве положительных контролей, т.е. экспериментальные данные объективны. В то же время исследуемый препарат не вызывал достоверного увеличения числа ревертантов.
Таблица 1. Действие препарата "ЛИВ52" на индикаторный штамм бактерий ТА 98 в тесте Эймса.
| Исследуемое вещество | Доза, мкг/ чашку | Штамм ТА 98 | -S9 | +S9 | ||||||
| Mi | М | Мо/Мк | МА | Mi | М | Мо/Мк | МА | |||
| Контроль Н2О | 0 | 30, 34, 36 | 33,2 | 36, 40, 39 | 38,3 | |||||
| Контроль глицерин* | о | 37, 28, 33 | 32,5 | 29, 33, 48 | 34,2 | |||||
| 2-АА | 10 | 2170, 1550, 2728 | 2093,5 | 60,3 | + | |||||
| 4-НХО | 10 | 342, 288, 334 | 320,4 | 9,8 | + | |||||
| Препарат "ЛИВ52" | 0,1 | 32, 29, 33 | 31,3 | d> | 0,96 | - | 35, 28, 37 | 33,1 | 0,96 | - | 1,0 | 32, 29, 39 | 33,1 | 1,01 | - | 39, 31. 22 | 29,8 | 0,87 | - | 10.0 | 38, 29, 36 | 34,1 | 1,04 | - | 46, 32, 39 | 38,6 | 1,12 | - | 100,0 | 38, 25, 31 | 30,9 | 0,95 | - | 34, 41, 34 | 36,2 | 1,07 | - | 1000,0 | 28, 32, 32 | 31,0 | 0,95 | - | 30, 25, 26 | 26,9 | 0,78 | - |
Условные обозначения и сокращения: Mi - число ревертантов на чашку, М - среднее геометрическое, Мо/Мк - отношение числа ревертантов в опыте к числу ревертантов в контроле, МА - мутагенная активность: "+" - наличие активности, "-" - отсутствие активности. Глицерин * - разведение глицерина 2:1.
Таблица 2. Влияние препарата "ЛИВ52" на индикаторный штамм бактерий ТА 100 в тесте Эймса.
| Исследуемое вещество | Доза, мкг/ чашку | Штамм ТА 100 | -S9 | +S9 | |||||
| Mi | М | Мо/Мк | МА | Mi | М | Мо/Мк | МА | ||
| Контроль Н2О | 125, 124, 94 | 113,3 | 98, 91, 106 | 96,9 | |||||
| Контроль глицерин* | 104, 98, 86 | 95,7 | 115,109, 90 | 104,1 | |||||
| 2-АА | 10 | 3162, 3471, 3038 | 3218,9 | 30,9 | + | ||||
| 4-НХО | 10 | 3100, 1922, 2514 | 2589,4 | 27,0 | + | ||||
| Азид натрия | 1,5 | 1087,6 | + | ||||||
| Препарат "ЛИВ52" | 0,1 | 112, 96, 111 | 106,1 | 1,1 | - | 101, 102, 112 | 104,9 | 1,0 | - | 1,0 | 105, 99, 90 | 97,8 | 1,02 | - | 99, 118, 129 | 114,6 | 1,1 | - | 10,0 | 103, 125, 114 | 113,6 | 1,18 | - | 133, 107, 118 | 118,9 | 1,1 | - | 100,0 | 109, 109, 100 | 105,9 | 1,1 | - | 115, 85, 113 | 103,4 | 0,99 | - | 1000,0 | 90, 95, 105 | 96,5 | 1,0 | - | 122,115, 86 | 106,5 | 1,02 | - |
Таблица З. Влияние препарата "ЛИВ52" на индикаторный штамм бактерий ТА 1537 в тесте Эймса.
| Исследуемое вещество | Доза, мкг/ чашку | Штамм ТА 1537 | -S9 | +S9 | |||||
| Mi | М | Мо/Мк | МА | Mi | М | Мо/Мк | MA | ||
| Контроль H2O | 0 | 9, 11, 7 | 8,8 | 5, 5, 5 | 5,0 | ||||
| Контроль глицерин* | 0 | 8, 8, 12 | 9,2 | 7, 15, 3 | 11,1 | ||||
| 2-АА | 10 | 236, 220, 208 | 221,0 | 19,9 | + | ||||
| 9-АА | 20 | 11160, 10044, 11718 | 10951,5 | 1190 | + | ||||
| Препарат "ЛИВ52" | 0,1 | 12, 8, 12 | 10,5 | 1,14 | - | 9, 8, 8 | 8,3 | 0,74 | - | 1,0 | 10, 8, 8 | 8,6 | 0,93 | - | 10, 8, 8 | 8,6 | 0,77 | - | 10,0 | 10, 10, 11 | 10,3 | 1,12 | - | 7, 6, 8 | 7,0 | 0,62 | - | 100,0 | 12, 10, 10 | 10,6 | 1,15 | - | 8, 10, 9 | 9,0 | 0,81 | - | 1000,0 | 7, 7, 5 | 6,3 | 0,68 | - | 13, 12, 15 | 13,3 | 1,19 | - |
Условные обозначения и сокращения: Mi - число ревертантов на чашку, М -среднее геометрическое, Мо/Мк - отношение числа ревертантов в опыте к числу ревертантов в контроле, МА - мутагенная активность: "+" - наличие активности, "-"- отсутствие активности. Глицерин * - разведение глицерина 2:1.Из представленных выше данных можно сделать вывод о том, что "ЛИВ52" в концентрациях 0.1 - 1000 мкг/чашку не вызывает увеличения количества ревертантов в штаммах Salmonella typhimurium TA98, ТА100, ТА1537, т.е. не обладает мутагенным действием в тесте Эймса.
1.2. Изучение влияния препарата "ЛИВ52" на индукцию доминантных летальных мутаций в зародышевых клетках мышей.
Цели исследования:
Опыты проводились с целью оценить потенциальные мутагенные свойства исследуемого вещества в экспериментах по изучению доминантных летальных мутаций у мышей-гибридов F1 (CBA x C57Bl6).
Обоснование исследования:
Изучаемое вещество исследовано для того, чтобы определить, вызывает ли оно увеличение количества летальных мутаций в половых клетках самцов, обработанных препаратом на разных стадиях сперматогенеза.
Обоснование выбора вида животных:
Мыши-гибриды F1 (CBA x C57Bl6) являются рекомендуемым для этих исследований объектом.
Обоснование способа применения препарата:
Применение исследуемого вещества внутрижелудочно, через катетер, в 1% крахмальном геле соответствует рекомендуемому пероральному способу применения у людей.
Дозировка:
Исследуемый препарат вводился самцам внутрижелудочно, однократно, в дозе, в 100 раз превышающей рекомендуемую высшую суточную дозу для человека (5140 мг/кг).
Дата проведения теста доминантных леталей:
начало - 6 июня 2001 г. окончание - 5 июля 2001 г.
Материалы и методы:
В лаборатории лекарственной токсикологии существуют стандартные инструкции ДЛЯ проведения исследования доминантных летальных мутаций. Данными инструкциями располагают научные сотрудники, проводившие исследования.
Руководитель исследования был информирован обо всех непредвиденных или предполагаемых изменениях, вносимых в вышеупомянутую инструкцию.
Исследуемое вещество:
Название - "ЛИВ52", субстанция.
Производитель-поставщик - Трансатлантик Интернейшнл
Взвесь в 1 % крахмальном геле.
Взвесь готовилась в день применения. 50 мг порошка растирали, взвешивали в 1 % крахмальном геле, перемешивали с помощью Vortex до получения однородной суспензии, вводили внутрижелудочно через зонд. Дозировка вычислялась в соответствии с объемом при введении.
Экспериментальные животные:
Вид: мыши-гибриды F1 (CBA x C57Bl6).
Животных получали из питомника "Столбовая". Животные были здоровы, имели ветеринарный сертификат качества и состояния здоровья.
Перед экспериментом животных содержали в карантине в течение 2 недель для выявления неконтролируемых беременностей у самок.
Животных содержали в клетках типа Т-3, в условиях естественного освещения при температуре 20-22 градуса и относительной влажности 60-65% на подстилке из древесных стружек, простерилизованных в сухожаровом шкафу.
Животные получали в неограниченном количестве водопроводную питьевую воду, поставляемую Рублевской водонапорной станцией.
Для питья использовали поилки. (500-мл стеклянные бутыли с конической пробкой из нержавеющей стали с отверстием в центре).
Кормление проводили в одно и то же время. Животные получали стандартный брикетированный корм ПК-120, изготавливаемый научно-производственным объединением "Сельскохозяйственные технологии"
Состав:
1. Ячмень
2. Овес
3. Пшеница
4. Шрот подсолнечный
5. Рыбная мука
6. Мука мясокостная
7. Масло растительное нерафинированное
8. Дрожжи кормовые
9. Патока кормовая
10. Соль поваренная
11. Премикс минерально-витаминный (П 51-1)
12. Энзимы
Показатели качества:
1 .Сырой протеин 23,6
2. Обменная энергия 290,0
3. Сырая клетчатка 3,58
4. Сырой жир 4,19
5. Кальций 1,2
6. Фосфор 0,79
7. Натрий хлористый 0,34
8. Метионин + цистеин 0,90
9. Железо 129,640
10 Медь 80,600
11. Цинк 102,140
12. Кобальт 0,334
13. Йод 1,050
14. Марганец 60,1
Содержит витамины (г):
Е 6,00; С 3,00; В1 3,00; В2 12,00; В3 10,12; В4 150; В6 30,0; B12 0,04.
Комбикорм гранулированный, диаметр гранул 9,8 мм.
Фасовка - бумажные крафт-мешки.
Дата изготовления
Срок хранения 6 месяцев.
Комбикорм сбалансирован по аминокислотному составу, минеральным веществам и витаминам, изготовлен из высококачественных компонентов. Проведены лабораторные исследования на токсичность. Корм не токсичен.
Корм и воду животные получали без ограничений. Самцов содержали в клетках по 1 особи. До подсадки к самцам самок содержали в клетках по 7-8 особей.
Сущность метода доминантных летальных мутаций заключается в том, что под воздействием лекарственных препаратов и химических веществ могут произойти генетические изменения в гамете, которые убивают зиготу, развившуюся из этой гаметы.
Доминантные летальные мутации у млекопитающих были впервые исследованы в 1937 г. Brenneke. Впервые они были использованы как индикаторы мутаций в 1953 г. Kaplan and Lyon и в 1954 Russe! et al. В 1966 г Bateman A.J. предложил использовать тест в скрининге химических мутагенов. С тех пор он широко используется во многих лабораториях мира и в соответствии с рекомендациями Фармакологического государственного комитета МЗ России является обязательным при оценке мутагенности потенциальных лекарственных препаратов в нашей стране.
Испытуемым лекарственным препаратом или химическим веществом обрабатывают самцов. Если вещество обладает мутагенным действием, то под его влиянием в сперматозоидах самца возникают доминантные летальные мутации. Обработанных препаратом самцов скрещивают с интактными самками, которых забивают в определенный период беременности и производят подсчет зародышей, погибших на ранней стадии и получивших обратное развитие. Самок периодически заменяют, что позволяет судить о мутациях, произошедших в половых клетках самцов на разных стадиях развития сперматозоидов.
Метод обнаружения доминантных летальный мутаций, как и все другие тесты, имеет ряд слабых мест. Для того, чтобы отличить случаи гибели зародышей в результате воздействия испытуемого вещества от гибели под воздействием факторов внешней среды на материнский организм в процессе беременности, результаты эксперимента сравниваются с результатами контрольного опыта, проводящегося одномоментно с испытанием в тех же условиях и на таких же животных, как и при исследовании лекарственного препарата или химического соединения. При анализе результатов этих исследований необходимо учитывать системы репарации поврежденной ДНК, имеющиеся не только в сперматозоидах, но и в яйцеклетках, которые могут залечить повреждения, имеющиеся в наследственном аппарате сперматозоидов. Для того, чтобы повысить чувствительность метода, исследование проводится на гибридах 1-го поколения (F1) специально выбранных для этой цели линий мышей.
Чтобы повысить достоверность полученных результатов исследования проводятся на значительном количестве животных и анализируются с помощью соответствующих статистических методов.
Доминантные летальные мутации- генетические изменения, индуцированные в родительских зародышевых клетках и приводящие к гибели первое поколение потомков на эмбриональных стадиях развития. Большая часть доминантных деталей представляют собой численные и структурные аберрации хромосом, частично - генные мутации. Мутагенный эффект проявляется в виде повышенной эмбриональной смертности. Если яйцеклетка оплодотворена сперматозоидом, несущим доминантную леталь, смерть развивающегося эмбриона может произойти как до, так и после имплантации. В соответствии с рекомендациями Фармакологического государственного комитета МЗ РФ (2000), при оценке мутагенных свойств "ЛИВ52" учитывалась постимплантационная смертность.
Использовали гибриды первого поколения мышей F1 (CBA x C57Bl6). Самцам вводили "ЛИВ52", внутрижелудочно однократно в 1 % крахмальном геле, в объеме 0,5 мл, в дозе 5140 мг/кг, что соответствовало дозе, равной 100-кратной высшей суточной дозе для человека. Контрольная группа животных получала внутрижелудочно 1 % крахмальный гель в том же объеме.
В опытной группе было 12 самцов, в контрольную группу в группу стандартного контроля - 12 самцов. После введения препарата к каждому самцу подсаживали по 3 интактных виргинных самки. Через каждые 7 дней самок отсаживали, заменяя их новыми. Отсаженных самок вскрывали на 15-17 день беременности, производили учет количества живых и мертвых эмбрионов. Повышенная эмбриональная смертность плодов у самок, забеременевших в первую неделю после введения химического вещества свидетельствует о мутационных изменениях в зрелых спермиях, во вторую неделю - в поздних сперматидах, в третью - в ранних сперматидах.
Результаты вскрытия фиксировали для каждой самки отдельно, затем суммировали.
Основным показателем уровня доминантных летальных мутаций служил уровень постимплантационных потерь- показатель, характеризующий постимплантационную выживаемость, Его определяли по формуле:
| А = | d | l+d |
где d - число погибших эмбрионов, l - число живых эмбрионов.
Определение достоверности различий в опытной и контрольной группах проводилось с помощью критерия χ 2 по формуле:
| χ 2 | ([ad - bc] - 0,5N)2N | (a + b)(c + d)(a + c)(b + d) |
где
а - мертвые эмбрионы, контроль
b - мертвые эмбрионы, опыт
с - живые эмбрионы, контроль
d - живые эмбрионы, опыт
N=a+b+c+d
Результаты опытов приведены в таблице 4.
Таблица 4. Результаты изучения способности "ЛИВ52" индуцировать доминантные летальные мутации в зародышевых клетках мышей.
| Стадия сперматогенеза | Доза | Всего самок | Число беременных самок | Фертильность % | Постимплантационные потери | χ2 |
| Зрелые спермии | 0
"ЛИВ52" | 35 36 | 30 32 | 86% 89% | 0,045 0,068 | 0,81 |
| Поздние сперматиды | 0
"ЛИВ52" | 35 36 | 28 28 | 80% 78% | 0,066 0,050 | - |
| Ранние сперматиды | 0
"ЛИВ52" | 34 36 | 28 29 | 82% 81% | 0,047 0,053 | 0,11 |
Как видно из таблицы, уровень постимплантационных потерь у животных, подвергавшихся воздействию "ЛИВ52", однократно, внутрижелудочно, в дозе равной 100-кратной высшей суточной терапевтической для человека (5140 мг/кг) несколько повышался по сравнению с контролем в стадии зрелых спермиев (χ2 = 0,81) и ранних сперматидов (χ 2 = 0,11), однако это повышение по критерию χ 2 для "ЛИВ52" не было статистически достоверным.
Таким образом, исследуемый препарат о дозе, в 100 раз превышающей высшую суточную дозу для человека, не индуцирует доминантные летальные мутации в зрелых спермиях, поздних сперматидах и ранних сперматидах мышей F1 (CBA x C57Bl6), т.е. не обладает мутагенной активностью в тесте доминантных леталей.
1.3. Изучение влияния "ЛИВ52" на систему репарации ДНК в SOS-хромотесте.
Оборудование, используемое при проведении SOS-хромотеста:
| Название | Фирма | Страна-производитель |
| Весы лабораторные | Sartorius GMBH Gottingen | Germany |
| Finnpipette Digital (микропипетки от 5 до 5000 мкл) | Labsystems | Finland |
| Vortex-2 Genie | Scientific industries, Inc. | USA |
| Framo-Geratetechnik (магнитная мешалка) | Franz Moral Laakintasahko | |
| Автоклав ~ 46Е | Finn-Aqua Santasalo-sonlberg AB. | Finland |
| Ламинарный шкаф | BABCOCK-BSH, Laminar-Flow | Germany |
| Весы лабораторные | Sartorius GMBH Gottingen | Germany |
| Термостат | Labortechnik | GDR |
| Автоматический микробиологический анализатор "Биоскрин" | Labsystems | Finland |
Список химических реактивов и расходных материалов, используемых при проведении SOS-хромотеста.
| Химические реактивы и пластик | Фирма | Страна - производитель |
| Диметилсульфоксид | "MERCK" | Germany |
| Дрожжевой экстракт Bacto | "Difco" | USA |
| Пептон Bacto | "Difco" | USA |
| Глюкозо-6-фосфат | "Fluka" | Switzerland |
| D (+)-Глюкоза (моногидрат) | "MERCK" | Germanyj |
| Na2HP04 x 2H2O | "MERCK" | Germany |
| NaH2P04 x H2O | "MERCK" | Germany |
| MgS04 | "MERCK" | Germany |
| β-mercaptoetanol | "SIGMA" | USA |
| Додецилсульфат натрия | "SIGMA" | USA |
| o-Нитрофенил-β-D-галактопиранозид | - | - |
| p-Нитрофенилфосфат | - | - |
| NaCl | "MERCK" | Germany |
| КСl | "Fluka" | Switzerland |
| 4-Нитрохинолин-N-оксид | "SIGMA" | USA |
| 2-Аминоантрацен | "SIGMA" | USA |
| Трис-(гидроксиметил)-аминометан | "Fluka" | Switzerland |
| Тризма гидрохлорид (Трис-(гидроксиметил)-аминометан гидрохлорид) | "SIGMA" | USA |
| МgСl2 x 6Н2О | "MERCK" | Germany |
| НАДФ (C21H27N17ОP3Na) | "SIGMA" | USA |
| Наконечники для пипеток, пластиковые, стерильные, одноразовые | Labsystems | Finland |
| Плашки пластиковые, с оптическим дном, стерильные, одноразовые для "Биоскрин" | Labsystems | Finland |
| Стрипы пластиковые, одноразовые, стерильные | Labsystems | Finland |
| Контейнеры для стрипов, одноразовые | Labsystems | Finland |
Дата проведения исследования 13-20 июля 2001 г.
Одним из тестов на повреждение ДНК является тест на определение индукции SOS-ответа бактериальной клетки на воздействие испытуемого агента, так называемый SOS-хромотест. Тест разработан Quillardet с соавторами (1982, 1985). Он основан на знаниях о SOS-ответе на ДНК-повреждения. Основой теста является штамм Escherichia coli PQ37, сконструированный посредством объединения lacZ, отвечающего за синтез фермента β-галактозидазы, с геном sfiA, контролируемым генеральным репрессором SOS-системы. Экспрессия sfiA индуцируется после повреждения ДНК как часть SOS-ответа. В этом тесте SOS-экспрессия измеряется по количественному определению ферментной активности β-галактозидазы, которая может быть измерена по цветной реакции. Маркером роста клеток в этом штамме является щелочная фосфатаза, которую также можно количественно измерить по цветной реакции.
В результате анализа получают кривые зависимости синтеза β-галактозидазы от концентрации исследуемого вещества и кривые, характеризующие динамику роста бактерий в этих условиях. По этим показателям определяется SOS-индуцирующая потенция, отражающая способность вещества индуцировать экспрессию гена sfiА.
Мы проводили этот тест с помощью автоматического микробиологического анализатора "Биоскрин" фирмы Лабсистемс (Финляндия), управляемого ЭВМ Оливетти М24 по разработанной фирмой Лабсистемс программе "SOS-хромотест, версия 1.2". Исследовали способность "ЛИВ52" активировать SOS-систему как в условиях метаболической активации микросомальной фракцией печени крысы (S9), так и без нее.
Для проведения теста препарат "ЛИВ52" приготавливали следующим образом: 10 мг стерильного препарата растворяли в 1 мл дистиллированной воды (30 мин перемешивания на VORTEX), и вносили в инкубационную смесь, содержащую бактерии, питательную среду, диметилсульфоксид и S9. Реакция идет в объеме 230 мкл. Инкубировали 120 мин при 37°С. Исследовали 8 последовательных концентраций препарата (разведения 1:2). Наибольшая концентрация, 2,5 мг/мл, затем 1,25 мг/мл, 0,62 мг/мл, 0.31 мг/мл, 0,15 мг/мл, 0,07 мг/мл, 0,035 мг/мл, 0,017 мг/мл. После 2-х часовой инкубации при 37°С, в пробах определяли активность щелочной фосфатазы, являющейся маркером роста бактерий, по цветной реакции с p-нитрофенилфосфатом; β-галактозидазу по реакции с O-нитрофенил-β-D-галактопиранозидом, измеряя динамику развития цветной реакции при 420 нм в течение 30 мин. Обработка результатов проведена по программе, предложенной Лабсистемс. Программа обработки результатов дает возможность определить для каждой концентрации исследуемого вещества отношение активности β-галактозидазы к активности щелочной фосфатазы и вычислить фактор индукции, зависимость фактора индукции от концентрации исследуемого вещества, определить SOSIP и сделать вывод о степени мутагенности исследуемого вещества.
Для проверки адекватности работы бактериальных штаммов, микросомальной активирующей смеси и красителей в каждом опыте использовали положительные контроли - вещества, вызывающие активацию SOS - системы: 4-нитрохинолин-N-оксид (прямой мутаген) и 2-аминоантрацен (мутаген, вызывающий активацию SOS-функции только в присутствии S9).
Результаты опытов показали, что "ЛИВ52" ни в одной из исследованных концентраций фактор индукции не превышал 0,9 т.е. "ЛИВ52" не вызывает активации системы репарации ДНК у E.coli PQ37, т.е. не обладает ДНК - повреждающим действием.
Заключение: На основании проведенных исследований можно сделать вывод, что "ЛИВ52" в концентрациях 0,1-1000 мкг/чашку не обладает мутагенным действием в тесте Эймса, в дозе 5140 мг/кг, равной 100-кратной терапевтической, не вызывает индукцию доминантных деталей у мышей-гибридов первого поколения F1 (CBA х C57Bl6), а также по результатам SOS-хромотеста не является потенциальным канцерогеном.
В проведении исследований по токсикологическому изучению ЛИВ52 принимали участие следующие сотрудники лаборатории лекарственной токсикологии НИИЭК РКНПК МЗ РФ:
1. Малиновская К.И., вед. науч. сотр.
2. Левицкая Е.Л., науч. сотр.
3. Поликарпова С. И., науч.сотр.
4. Тихонова Е.В., мл.науч.сотр.
