Отчет о токсикологическом изучении препарата ЛИВ52

Комментарии
Российский кардиологический научно-производственный комплекс министерства здравоохранения РФ
Научно-исследовательский институт экспериментальной кардиологии
Лаборатория лекарственной токсикологии
Руководитель - доктор медицинских наук, профессор Е. В. Арзамасцев

Москва - 2001

Исследование мутагенности препарата "ЛИВ52" проведено в лаборатории лекарственной токсикологии НИИ экспериментальной кардиологии Российского кардиологического научно-производственного комплекса Министерства здравоохранения России, руководитель лаборатории - профессор Е.В. Арзамасцев.

Руководитель исследований - доктор медицинских наук, профессор Е В. Арзамасцев.
Ответственный исполнитель - ведущий научный сотрудник; кандидат биологических наук К. И. Малиновская.
Исполнители:
научный сотрудник, кандидат биологических наук С. И. Поликарпова, научный сотрудник Е.Л. Левицкая, младший научный сотрудник Е.В. Тихонова.

Исследуемое вещество: "ЛИВ 52", субстанция.

Спонсор: Трансатлантик интернэйшнл ПТЕ. ЛТД. Россия, Москва 107078 Орликов пер. дом 10.

Системы исследования:
1.Тест Эймса.
2. Исследование индукции доминантных летальных мутаций у мышей.
3. Влияние на систему репарации ДНК в SOS-хромотесте.

Исследование мутагенности препарата "ЛИВ52" было проведено в соответствии с требованиями Фармакологического комитета МЗ РФ.

1.1. Изучение мутагенных свойств препарата "ЛИВ52" на микроорганизмах в тесте Эймса.
Оборудование, используемое при проведении теста Эймса:

Название Фирма Страна-производитель
Becы лабораторные Sartorius GMBH Gottingen Germany
Микропипетки Finnpipette Gigital от 5 до 5000 мкл Labsystems Finland
Vortex-2 Genie Scientific industries, Inc. USA
магнитная мешалка Framo-Geratetechnik Franz Moral Laakintasahko -
Instrutemp (водяная баня с термостатом) Instrumentarium Finland
Автоклав -46Е Finn-Aqua Santasalo-sohlberg AB. Finland
Стерилизатор на горячем воздухе 4-14 М Finn-Aqua Santasalo-sohlberg AB. Finland
Ламинарный шкаф BABCOCK-BSH. Laminar-Flow Germany
Счетчик для подсчета колонийNsw Brunswick scientificUSA
Термостат Labortechnik GDR
СВЧ-печка Samsung Korea

Список химических реактивов и расходных материалов, используемых в тесте Эймса.

Химические реактивы и расходный пластик Фирма Страна - производитель
Питательный бульон № 2 "Oxoid" England
Дрожжевой экстракт Bacto "Difco" USA .
Bacto - агар "Difco" USA
D (+)-Глюкоза (моногидрат) "MERCK" Germany
MgSО4 х 7H2О "MERCK" Germany
Лимонная кислота (C6H8O7) "SERVA" USA
К2НРО4 х 3H2O "Диa - M" Россия
NaNH4HPO4 х 4H2О "MERCK" Germany
NaCl "MERCK" Germany
L-Гистидин "MERCK" Germany
d - Биотин (Витамин H) "SIGMA" USA
KCI "Fluka" Switzerland
Глюкозо-6-фосфат "Reanal" Hungary
НАДФ (C21H27N7О17P3Na) "Reana!" Hungary
Трис-(гидроксиметил)-аминометан "Fluka" Switzerland
Тризма гидрохлорид (Трис-(гидроксиметил)-аминометан гидрохлорид) "SIGMA" USA
МgСl2 x 6Н2О "MERCK" Germany
Наконечники для пипеток, пластиковые, стерильные, одноразовые Labsystems Finland
Чашки Петри, пластиковые, стерильные, одноразовые - -
Совол - Россия
9-Аминоакридин "SIGMA" USA
4-Нитрохинолин-N-оксид "SIGMA" USA
2-Аминоантрацен Serva USA
Глицерин "Fluka" Switzerland

Дата проведения теста Эймса: 10-13 июля 2001 г.

Оценка мутагенной активности препарата "ЛИВ52" проведена методом учета способности соединения индуцировать генные мутации у индикаторных микроорганизмов в системе метаболической активации in vitro и без системы метаболической активации. Использован чашечный метод учета мутаций, предложенный Ames et al. (1972,1984) в модификации, описанной в "Руководстве по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ" (Москва,2000), рекомендованном Фармакологическим государственным комитетом МЗ России по тестированию препаратов на стадии их доклинического токсикологического изучения.

В качестве индикаторных микроорганизмов использовали ауксотрофные по гистидину штаммы Saimonella typhimurium TA98, ТА100, ТА1537. О наличии мутагенного действия препарата судили по индукции обратных мутаций от ауксотрофности по гистидину к прототрофности.

Штамм TA98 несет мутацию his D3052, фреймшифт мутацию типа -1. Реверсия к дикому типу происходит за счет делеции

Ц-Г
Г-Ц
в последовательности
Ц-Г-Ц-Г-Ц-Г-Ц-Г
Г-Ц-Г-Ц-Г-Ц-Г-Ц,
находящейся недалеко от сайта мутации.

Мутация his D3052 использована в тесторном штамме для доказательства способности изучаемого вещества индуцировать мутации типа сдвига рамки считывания. В качестве позитивного контроля на мутацию his D3052 использовали 4-нитрохинолин-N-оксид (4-НХО).

Мутация, his C3076 - это мутация сдвига рамки считывания штамма ТА1537. Последовательность ДНК мутанта his C3076 не определена, однако известно, что она содержит один добавленный цитозин к ряду из трех цитозинов и супрессируется супрессором suf В. Как позитивный контроль на мутацию his C3076 использовали 9-аминоакридин (9-АА).

Штамм ТА100 несет мутацию his G46, миссенс-мутацию, ревертирующую под действием многих мутагенов, индуцирующих замены пар оснований. В качестве положительного контроля на эту мутацию применяли азид натрия.

Метод позволяет изучить как прямое действие исследуемого вещества на тесторные штаммы, так и действие его метаболитов, образующихся под влиянием микросомальной фракции индуцированной печени крысы.

Перед работой штаммы были проверены на ауксотрофность к гистидину, на наличие у штаммов TA98 и ТА100 плазмиды рКМ 101 и наличие мутации rfa.

Для проведения теста Эймса препарат "ЛИВ52" получали следующим образом: приготавливали взвесь 10 мг полученного от производителя стерильного препарата в 1 мл стерильного 50% раствора глицерина, дальнейшие разведения готовили на глицерине и вносили на чашки Петри. Исследовали концентрации препарата от 0,1 до 1000 мкг/ чашку.

Селективный полуобогащенный агар в пробирках в объеме 2 мл плавили в СВЧ-печке, охлаждали в термостатируемой водяной бане до температуры 44-45°С. В пробирки с агаром вносили 100 мкл взвеси препарата, 100 мкл суспензии ночной культуры бактерий, 100 мкл фракции S9 печени крысы и кофакторы. Микросомальную фракцию печени крысы, индуцированной Арохлором, получали в виде лиофилизата у фирмы Labsystems, Финляндия. Проводили опыт как с полной микросомальной активирующей смесью, ПАМС, так и с неполной активирующей микросомальной смесью, НАМС.

Указанные смеси вносили в пробирки после извлечения их из термостатирующей бани и тут же наносили полужидкий агар на слой минимального агара на чашках Петри. После полного застывания агара чашки переносили в термостат при 37°С. На каждую дозу препарата делали 3 повторности с ПАМС и 3 повторности с НАМС. Через 48 часов инкубации при 37°С производили учет прототрофных ревертантов.

Оценку результатов проводили по алгоритму, приведенному в "Методических рекомендациях". Для каждого варианта рассчитывали среднее геометрическое число ревертантов с определением

_________
Хi=3xi1*xi2*xi3

где Xi - число ревертантов в чашках Петри 1,2,3 на дозе i.

Для каждого опытного варианта находили кратность превышения среднего геометрического числа ревертантов в опыте над контролем и сравнивали с критическим значением, приведенным в "Методических рекомендациях" (1,9 для штамма ТА1537 и 1,5 для штаммов ТА98 и ТА100).

Как видно из данных, представленных в Таблице 1, бактериальные штаммы увеличивали число ревертантов под действием веществ, взятых в качестве положительных контролей, т.е. экспериментальные данные объективны. В то же время исследуемый препарат не вызывал достоверного увеличения числа ревертантов.

Таблица 1. Действие препарата "ЛИВ52" на индикаторный штамм бактерий ТА 98 в тесте Эймса.

Исследуемое вещество Доза, мкг/ чашку Штамм ТА 98
-S9 +S9
Mi М Мо/Мк МА Mi М Мо/Мк МА
Контроль Н2О 0 30, 34, 36 33,2 36, 40, 39 38,3
Контроль глицерин* о 37, 28, 33 32,5 29, 33, 48 34,2
2-АА 10 2170, 1550, 2728 2093,5 60,3 +
4-НХО 10 342, 288, 334 320,4 9,8 +
Препарат "ЛИВ52" 0,132, 29, 33 31,3d> 0,96 - 35, 28, 37 33,1 0,96 -
1,0 32, 29, 39 33,1 1,01 - 39, 31. 22 29,8 0,87 - 10.0 38, 29, 36 34,1 1,04 - 46, 32, 39 38,6 1,12 - 100,0 38, 25, 31 30,9 0,95 - 34, 41, 34 36,2 1,07 - 1000,0 28, 32, 32 31,0 0,95 - 30, 25, 26 26,9 0,78 -

Условные обозначения и сокращения: Mi - число ревертантов на чашку, М - среднее геометрическое, Мо/Мк - отношение числа ревертантов в опыте к числу ревертантов в контроле, МА - мутагенная активность: "+" - наличие активности, "-" - отсутствие активности. Глицерин * - разведение глицерина 2:1.

Таблица 2. Влияние препарата "ЛИВ52" на индикаторный штамм бактерий ТА 100 в тесте Эймса.

Исследуемое вещество Доза, мкг/ чашку Штамм ТА 100
-S9 +S9
Mi М Мо/Мк МА Mi М Мо/Мк МА
Контроль Н2О 125, 124, 94 113,3 98, 91, 106 96,9
Контроль глицерин* 104, 98, 86 95,7 115,109, 90 104,1
2-АА 10 3162, 3471, 3038 3218,9 30,9+
4-НХО 10 3100, 1922, 2514 2589,4 27,0 +
Азид натрия 1,5 1087,6 +
Препарат "ЛИВ52" 0,1 112, 96, 111 106,1 1,1 - 101, 102, 112 104,9 1,0 -
1,0 105, 99, 90 97,8 1,02 - 99, 118, 129 114,6 1,1 - 10,0 103, 125, 114 113,6 1,18 - 133, 107, 118 118,9 1,1 - 100,0 109, 109, 100 105,9 1,1 - 115, 85, 113 103,4 0,99 - 1000,0 90, 95, 105 96,5 1,0 - 122,115, 86 106,5 1,02 -

Таблица З. Влияние препарата "ЛИВ52" на индикаторный штамм бактерий ТА 1537 в тесте Эймса.

Исследуемое вещество Доза, мкг/ чашку Штамм ТА 1537
-S9 +S9
Mi М Мо/Мк МА Mi М Мо/Мк MA
Контроль H2O 0 9, 11, 7 8,8 5, 5, 5 5,0
Контроль глицерин* 0 8, 8, 12 9,2 7, 15, 3 11,1
2-АА 10 236, 220, 208 221,0 19,9+
9-АА 20 11160, 10044, 11718 10951,5 1190 +
Препарат "ЛИВ52" 0,1 12, 8, 12 10,5 1,14 - 9, 8, 8 8,3 0,74 -
1,0 10, 8, 8 8,6 0,93 - 10, 8, 8 8,6 0,77 - 10,0 10, 10, 11 10,3 1,12 - 7, 6, 8 7,0 0,62 - 100,0 12, 10, 10 10,6 1,15 - 8, 10, 9 9,0 0,81 - 1000,0 7, 7, 5 6,3 0,68 - 13, 12, 15 13,3 1,19 -

Условные обозначения и сокращения: Mi - число ревертантов на чашку, М -среднее геометрическое, Мо/Мк - отношение числа ревертантов в опыте к числу ревертантов в контроле, МА - мутагенная активность: "+" - наличие активности, "-"- отсутствие активности. Глицерин * - разведение глицерина 2:1.Из представленных выше данных можно сделать вывод о том, что "ЛИВ52" в концентрациях 0.1 - 1000 мкг/чашку не вызывает увеличения количества ревертантов в штаммах Salmonella typhimurium TA98, ТА100, ТА1537, т.е. не обладает мутагенным действием в тесте Эймса.

1.2. Изучение влияния препарата "ЛИВ52" на индукцию доминантных летальных мутаций в зародышевых клетках мышей.
Цели исследования:

Опыты проводились с целью оценить потенциальные мутагенные свойства исследуемого вещества в экспериментах по изучению доминантных летальных мутаций у мышей-гибридов F1 (CBA x C57Bl6).

Обоснование исследования:
Изучаемое вещество исследовано для того, чтобы определить, вызывает ли оно увеличение количества летальных мутаций в половых клетках самцов, обработанных препаратом на разных стадиях сперматогенеза.

Обоснование выбора вида животных:
Мыши-гибриды F1 (CBA x C57Bl6) являются рекомендуемым для этих исследований объектом.

Обоснование способа применения препарата:
Применение исследуемого вещества внутрижелудочно, через катетер, в 1% крахмальном геле соответствует рекомендуемому пероральному способу применения у людей.

Дозировка:
Исследуемый препарат вводился самцам внутрижелудочно, однократно, в дозе, в 100 раз превышающей рекомендуемую высшую суточную дозу для человека (5140 мг/кг).

Дата проведения теста доминантных леталей:
начало - 6 июня 2001 г. окончание - 5 июля 2001 г.

Материалы и методы:
В лаборатории лекарственной токсикологии существуют стандартные инструкции ДЛЯ проведения исследования доминантных летальных мутаций. Данными инструкциями располагают научные сотрудники, проводившие исследования.
Руководитель исследования был информирован обо всех непредвиденных или предполагаемых изменениях, вносимых в вышеупомянутую инструкцию.

Исследуемое вещество:
Название - "ЛИВ52", субстанция.
Производитель-поставщик - Трансатлантик Интернейшнл

Взвесь в 1 % крахмальном геле.
Взвесь готовилась в день применения. 50 мг порошка растирали, взвешивали в 1 % крахмальном геле, перемешивали с помощью Vortex до получения однородной суспензии, вводили внутрижелудочно через зонд. Дозировка вычислялась в соответствии с объемом при введении.

Экспериментальные животные:
Вид: мыши-гибриды F1 (CBA x C57Bl6).
Животных получали из питомника "Столбовая". Животные были здоровы, имели ветеринарный сертификат качества и состояния здоровья.
Перед экспериментом животных содержали в карантине в течение 2 недель для выявления неконтролируемых беременностей у самок.
Животных содержали в клетках типа Т-3, в условиях естественного освещения при температуре 20-22 градуса и относительной влажности 60-65% на подстилке из древесных стружек, простерилизованных в сухожаровом шкафу.
Животные получали в неограниченном количестве водопроводную питьевую воду, поставляемую Рублевской водонапорной станцией.
Для питья использовали поилки. (500-мл стеклянные бутыли с конической пробкой из нержавеющей стали с отверстием в центре).
Кормление проводили в одно и то же время. Животные получали стандартный брикетированный корм ПК-120, изготавливаемый научно-производственным объединением "Сельскохозяйственные технологии"

Состав:
1. Ячмень
2. Овес
3. Пшеница
4. Шрот подсолнечный
5. Рыбная мука
6. Мука мясокостная
7. Масло растительное нерафинированное
8. Дрожжи кормовые
9. Патока кормовая
10. Соль поваренная
11. Премикс минерально-витаминный (П 51-1)
12. Энзимы

Показатели качества:
1 .Сырой протеин 23,6
2. Обменная энергия 290,0
3. Сырая клетчатка 3,58
4. Сырой жир 4,19
5. Кальций 1,2
6. Фосфор 0,79
7. Натрий хлористый 0,34
8. Метионин + цистеин 0,90
9. Железо 129,640
10 Медь 80,600
11. Цинк 102,140
12. Кобальт 0,334
13. Йод 1,050
14. Марганец 60,1

Содержит витамины (г):
Е 6,00; С 3,00; В1 3,00; В2 12,00; В3 10,12; В4 150; В6 30,0; B12 0,04.

Комбикорм гранулированный, диаметр гранул 9,8 мм.
Фасовка - бумажные крафт-мешки.
Дата изготовления
Срок хранения 6 месяцев.

Комбикорм сбалансирован по аминокислотному составу, минеральным веществам и витаминам, изготовлен из высококачественных компонентов. Проведены лабораторные исследования на токсичность. Корм не токсичен.

Корм и воду животные получали без ограничений. Самцов содержали в клетках по 1 особи. До подсадки к самцам самок содержали в клетках по 7-8 особей.

Сущность метода доминантных летальных мутаций заключается в том, что под воздействием лекарственных препаратов и химических веществ могут произойти генетические изменения в гамете, которые убивают зиготу, развившуюся из этой гаметы.

Доминантные летальные мутации у млекопитающих были впервые исследованы в 1937 г. Brenneke. Впервые они были использованы как индикаторы мутаций в 1953 г. Kaplan and Lyon и в 1954 Russe! et al. В 1966 г Bateman A.J. предложил использовать тест в скрининге химических мутагенов. С тех пор он широко используется во многих лабораториях мира и в соответствии с рекомендациями Фармакологического государственного комитета МЗ России является обязательным при оценке мутагенности потенциальных лекарственных препаратов в нашей стране.

Испытуемым лекарственным препаратом или химическим веществом обрабатывают самцов. Если вещество обладает мутагенным действием, то под его влиянием в сперматозоидах самца возникают доминантные летальные мутации. Обработанных препаратом самцов скрещивают с интактными самками, которых забивают в определенный период беременности и производят подсчет зародышей, погибших на ранней стадии и получивших обратное развитие. Самок периодически заменяют, что позволяет судить о мутациях, произошедших в половых клетках самцов на разных стадиях развития сперматозоидов.

Метод обнаружения доминантных летальный мутаций, как и все другие тесты, имеет ряд слабых мест. Для того, чтобы отличить случаи гибели зародышей в результате воздействия испытуемого вещества от гибели под воздействием факторов внешней среды на материнский организм в процессе беременности, результаты эксперимента сравниваются с результатами контрольного опыта, проводящегося одномоментно с испытанием в тех же условиях и на таких же животных, как и при исследовании лекарственного препарата или химического соединения. При анализе результатов этих исследований необходимо учитывать системы репарации поврежденной ДНК, имеющиеся не только в сперматозоидах, но и в яйцеклетках, которые могут залечить повреждения, имеющиеся в наследственном аппарате сперматозоидов. Для того, чтобы повысить чувствительность метода, исследование проводится на гибридах 1-го поколения (F1) специально выбранных для этой цели линий мышей.

Чтобы повысить достоверность полученных результатов исследования проводятся на значительном количестве животных и анализируются с помощью соответствующих статистических методов.

Доминантные летальные мутации- генетические изменения, индуцированные в родительских зародышевых клетках и приводящие к гибели первое поколение потомков на эмбриональных стадиях развития. Большая часть доминантных деталей представляют собой численные и структурные аберрации хромосом, частично - генные мутации. Мутагенный эффект проявляется в виде повышенной эмбриональной смертности. Если яйцеклетка оплодотворена сперматозоидом, несущим доминантную леталь, смерть развивающегося эмбриона может произойти как до, так и после имплантации. В соответствии с рекомендациями Фармакологического государственного комитета МЗ РФ (2000), при оценке мутагенных свойств "ЛИВ52" учитывалась постимплантационная смертность.

Использовали гибриды первого поколения мышей F1 (CBA x C57Bl6). Самцам вводили "ЛИВ52", внутрижелудочно однократно в 1 % крахмальном геле, в объеме 0,5 мл, в дозе 5140 мг/кг, что соответствовало дозе, равной 100-кратной высшей суточной дозе для человека. Контрольная группа животных получала внутрижелудочно 1 % крахмальный гель в том же объеме.

В опытной группе было 12 самцов, в контрольную группу в группу стандартного контроля - 12 самцов. После введения препарата к каждому самцу подсаживали по 3 интактных виргинных самки. Через каждые 7 дней самок отсаживали, заменяя их новыми. Отсаженных самок вскрывали на 15-17 день беременности, производили учет количества живых и мертвых эмбрионов. Повышенная эмбриональная смертность плодов у самок, забеременевших в первую неделю после введения химического вещества свидетельствует о мутационных изменениях в зрелых спермиях, во вторую неделю - в поздних сперматидах, в третью - в ранних сперматидах.

Результаты вскрытия фиксировали для каждой самки отдельно, затем суммировали.

Основным показателем уровня доминантных летальных мутаций служил уровень постимплантационных потерь- показатель, характеризующий постимплантационную выживаемость, Его определяли по формуле:

А =d
l+d

где d - число погибших эмбрионов, l - число живых эмбрионов.

Определение достоверности различий в опытной и контрольной группах проводилось с помощью критерия χ 2 по формуле:

χ 2([ad - bc] - 0,5N)2N
(a + b)(c + d)(a + c)(b + d)

где
а - мертвые эмбрионы, контроль
b - мертвые эмбрионы, опыт
с - живые эмбрионы, контроль
d - живые эмбрионы, опыт
N=a+b+c+d

Результаты опытов приведены в таблице 4.

Таблица 4. Результаты изучения способности "ЛИВ52" индуцировать доминантные летальные мутации в зародышевых клетках мышей.

Стадия сперматогенеза Доза Всего самок Число беременных самок Фертильность % Постимплантационные потери χ2
Зрелые спермии 0
"ЛИВ52"
35
36
30
32
86%
89%
0,045
0,068
0,81
Поздние сперматиды 0
"ЛИВ52"
35
36
28
28
80%
78%
0,066
0,050
-
Ранние сперматиды 0
"ЛИВ52"
34
36
28
29
82%
81%
0,047
0,053
0,11

Как видно из таблицы, уровень постимплантационных потерь у животных, подвергавшихся воздействию "ЛИВ52", однократно, внутрижелудочно, в дозе равной 100-кратной высшей суточной терапевтической для человека (5140 мг/кг) несколько повышался по сравнению с контролем в стадии зрелых спермиев (χ2 = 0,81) и ранних сперматидов (χ 2 = 0,11), однако это повышение по критерию χ 2 для "ЛИВ52" не было статистически достоверным.

Таким образом, исследуемый препарат о дозе, в 100 раз превышающей высшую суточную дозу для человека, не индуцирует доминантные летальные мутации в зрелых спермиях, поздних сперматидах и ранних сперматидах мышей F1 (CBA x C57Bl6), т.е. не обладает мутагенной активностью в тесте доминантных леталей.

1.3. Изучение влияния "ЛИВ52" на систему репарации ДНК в SOS-хромотесте.
Оборудование, используемое при проведении SOS-хромотеста:

Название Фирма Страна-производитель
Весы лабораторные Sartorius GMBH Gottingen Germany
Finnpipette Digital (микропипетки от 5 до 5000 мкл) Labsystems Finland
Vortex-2 Genie Scientific industries, Inc. USA
Framo-Geratetechnik (магнитная мешалка) Franz Moral Laakintasahko
Автоклав ~ 46Е Finn-Aqua Santasalo-sonlberg AB. Finland
Ламинарный шкаф BABCOCK-BSH, Laminar-Flow Germany
Весы лабораторные Sartorius GMBH Gottingen Germany
Термостат Labortechnik GDR
Автоматический микробиологический анализатор "Биоскрин" Labsystems Finland

Список химических реактивов и расходных материалов, используемых при проведении SOS-хромотеста.

Химические реактивы и пластик Фирма Страна - производитель
Диметилсульфоксид "MERCK" Germany
Дрожжевой экстракт Bacto "Difco" USA
Пептон Bacto "Difco" USA
Глюкозо-6-фосфат "Fluka" Switzerland
D (+)-Глюкоза (моногидрат) "MERCK" Germanyj
Na2HP04 x 2H2O "MERCK" Germany
NaH2P04 x H2O "MERCK" Germany
MgS04 "MERCK" Germany
β-mercaptoetanol "SIGMA" USA
Додецилсульфат натрия "SIGMA" USA
o-Нитрофенил-β-D-галактопиранозид - -
p-Нитрофенилфосфат - -
NaCl "MERCK" Germany
КСl "Fluka" Switzerland
4-Нитрохинолин-N-оксид "SIGMA" USA
2-Аминоантрацен "SIGMA" USA
Трис-(гидроксиметил)-аминометан "Fluka" Switzerland
Тризма гидрохлорид (Трис-(гидроксиметил)-аминометан гидрохлорид) "SIGMA" USA
МgСl2 x 6Н2О "MERCK" Germany
НАДФ (C21H27N17ОP3Na) "SIGMA" USA
Наконечники для пипеток, пластиковые, стерильные, одноразовые Labsystems Finland
Плашки пластиковые, с оптическим дном, стерильные, одноразовые для "Биоскрин" Labsystems Finland
Стрипы пластиковые, одноразовые, стерильные Labsystems Finland
Контейнеры для стрипов, одноразовые Labsystems Finland

Дата проведения исследования 13-20 июля 2001 г.

Одним из тестов на повреждение ДНК является тест на определение индукции SOS-ответа бактериальной клетки на воздействие испытуемого агента, так называемый SOS-хромотест. Тест разработан Quillardet с соавторами (1982, 1985). Он основан на знаниях о SOS-ответе на ДНК-повреждения. Основой теста является штамм Escherichia coli PQ37, сконструированный посредством объединения lacZ, отвечающего за синтез фермента β-галактозидазы, с геном sfiA, контролируемым генеральным репрессором SOS-системы. Экспрессия sfiA индуцируется после повреждения ДНК как часть SOS-ответа. В этом тесте SOS-экспрессия измеряется по количественному определению ферментной активности β-галактозидазы, которая может быть измерена по цветной реакции. Маркером роста клеток в этом штамме является щелочная фосфатаза, которую также можно количественно измерить по цветной реакции.

В результате анализа получают кривые зависимости синтеза β-галактозидазы от концентрации исследуемого вещества и кривые, характеризующие динамику роста бактерий в этих условиях. По этим показателям определяется SOS-индуцирующая потенция, отражающая способность вещества индуцировать экспрессию гена sfiА.

Мы проводили этот тест с помощью автоматического микробиологического анализатора "Биоскрин" фирмы Лабсистемс (Финляндия), управляемого ЭВМ Оливетти М24 по разработанной фирмой Лабсистемс программе "SOS-хромотест, версия 1.2". Исследовали способность "ЛИВ52" активировать SOS-систему как в условиях метаболической активации микросомальной фракцией печени крысы (S9), так и без нее.

Для проведения теста препарат "ЛИВ52" приготавливали следующим образом: 10 мг стерильного препарата растворяли в 1 мл дистиллированной воды (30 мин перемешивания на VORTEX), и вносили в инкубационную смесь, содержащую бактерии, питательную среду, диметилсульфоксид и S9. Реакция идет в объеме 230 мкл. Инкубировали 120 мин при 37°С. Исследовали 8 последовательных концентраций препарата (разведения 1:2). Наибольшая концентрация, 2,5 мг/мл, затем 1,25 мг/мл, 0,62 мг/мл, 0.31 мг/мл, 0,15 мг/мл, 0,07 мг/мл, 0,035 мг/мл, 0,017 мг/мл. После 2-х часовой инкубации при 37°С, в пробах определяли активность щелочной фосфатазы, являющейся маркером роста бактерий, по цветной реакции с p-нитрофенилфосфатом; β-галактозидазу по реакции с O-нитрофенил-β-D-галактопиранозидом, измеряя динамику развития цветной реакции при 420 нм в течение 30 мин. Обработка результатов проведена по программе, предложенной Лабсистемс. Программа обработки результатов дает возможность определить для каждой концентрации исследуемого вещества отношение активности β-галактозидазы к активности щелочной фосфатазы и вычислить фактор индукции, зависимость фактора индукции от концентрации исследуемого вещества, определить SOSIP и сделать вывод о степени мутагенности исследуемого вещества.

Для проверки адекватности работы бактериальных штаммов, микросомальной активирующей смеси и красителей в каждом опыте использовали положительные контроли - вещества, вызывающие активацию SOS - системы: 4-нитрохинолин-N-оксид (прямой мутаген) и 2-аминоантрацен (мутаген, вызывающий активацию SOS-функции только в присутствии S9).

Результаты опытов показали, что "ЛИВ52" ни в одной из исследованных концентраций фактор индукции не превышал 0,9 т.е. "ЛИВ52" не вызывает активации системы репарации ДНК у E.coli PQ37, т.е. не обладает ДНК - повреждающим действием.

Заключение: На основании проведенных исследований можно сделать вывод, что "ЛИВ52" в концентрациях 0,1-1000 мкг/чашку не обладает мутагенным действием в тесте Эймса, в дозе 5140 мг/кг, равной 100-кратной терапевтической, не вызывает индукцию доминантных деталей у мышей-гибридов первого поколения F1 (CBA х C57Bl6), а также по результатам SOS-хромотеста не является потенциальным канцерогеном.

В проведении исследований по токсикологическому изучению ЛИВ52 принимали участие следующие сотрудники лаборатории лекарственной токсикологии НИИЭК РКНПК МЗ РФ:
1. Малиновская К.И., вед. науч. сотр.
2. Левицкая Е.Л., науч. сотр.
3. Поликарпова С. И., науч.сотр.
4. Тихонова Е.В., мл.науч.сотр.

1 апреля 2013 г.
Комментарии (видны только специалистам, верифицированным редакцией МЕДИ РУ)
Если Вы медицинский специалист, войдите или зарегистрируйтесь
Связанные темы:

МЕДИ РУ в: МЕДИ РУ на YouTube МЕДИ РУ в Twitter МЕДИ РУ на FaceBook МЕДИ РУ вКонтакте Яндекс.Метрика