Механизмы противоотечного воздействия биофлавоноидов в эксперименте

Опубликовано в журнале:
« Ангиология и сосудистая хирургия » Том 19, №2/2013 Шишло В.К., Малинин А.А., Дюржанов А.А.
Отдел оперативной хирургии и клинической лимфологии РМАПО,
Научный центр сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева, Москва, Россия

В лечении хронических отеков различной этиологии большое значение имеет возможность воздействия на резорбционную, транспортную и пропускную функции лимфосистемы, а также на микроциркуляторное кровеносное русло, так как все они определяют баланс обмена жидкости в тканях. Существуют различные причины хронического отека, что требует дифференцированного подхода к применению биофлавоноидов с разным механизмом противоотечного воздействия.
С этой целью проведены экспериментальные, гистоморфометрические исследования на 24-х крысах по определению разнонаправленного воздействия препаратов из класса биофлаваноидов – Флебодиа 600 (диосмин) и троксерутина на регенераторную способность лимфатического эндотелия и проницаемость кровеносных капилляров.
Установлено, что Флебодиа 600 имеет прямое влияние на функциональное состояние лимфатической системы, активизирует пролиферацию лимфатического эндотелия путем почкования, что приводит к образованию новых капиллярных лимфатических сетей. В результате происходит увеличение общей всасывающей площади лимфатических капиллярных сетей и повышение объёма реабсорбции лимфы.
Троксерутин воздействует преимущественно на эндотелий кровеносных капилляров, снижает проницаемость в артериальном отделе капилляра, тем самым уменьшает общий объем жидкости в интерстициальном пространстве и соответственно нагрузку на лимфатическую систему.

Ключевые слова: биофлавоноиды, Флебодиа 600, троксерутин, стимуляция лимфангиогенеза, лимфатический отек, лимфовенозная недостаточность.

ВВЕДЕНИЕ

В норме объём образования лимфы должен быть равен объёму реабсорбции [1]. Одним из факторов развития отёка является резорбционная недостаточность корней лимфатической системы[1, 2]. Увеличение ультрафильтрации при флебогипертензии приводит к превышению транспортных возможностей лимфатической системы и в результате к декомпенсации лимфатического оттока и хроническому отеку [3].

При различных патологических состояниях начальных отделов лимфатической системы процессы реабсорбции лимфы нарушаются. Согласно данным Foldi M., Kubik S. [3], нарушения в лимфатической системе развиваются тогда, когда ёмкость транспорта меньше, чем процессы продукции лимфы, в связи с резким уменьшением общей резорбционной площади инициальных отделов лимфатической системы.

Восстановления необходимого резорбционного объема начального отдела лимфатической системы можно достигнуть путем стимуляции регенерации лимфатических микрососудов.

Исследования, проведенные Баниным В.В. и Куприяновым В.В. с соавт. [4, 5] доказали, что новый эндотелий, в том числе и лимфатический, в процессе ангиогенеза образуется только из уже существующих эндотелиальных клеток. Основой ангиогенеза во взрослом организме является рост микрососудов с помощью, так называемого, спроунта –образования выростов или капиллярных почек. В норме в зрелом возрасте у человека или экспериментальных животных процесс физиологической регенерации лимфатического русла протекает крайне медленно и при исследовании гистологических препаратов очень редко можно обнаружить вновь образовавшиеся лимфатические структуры. По данным Бородина Ю.М. с соавт. [6], лимфатические капилляры, а более конкретно их отростки – это звенья русла, которое максимально пластично и обладает потенцией к перестройке.

Однако усиленный рост лимфатических капилляров может возникнуть, как правило, только в случае повреждения, например при застое лимфы в связи с хронической недостаточностью кровообращения [7], реакции воспаления, опухолевом росте, ранении и т. д. [5]. Предполагается, что первичным ответом микрососуда на ангиогенное влияние является хемотаксическое вытягивание отростков эндотелиальных клеток по направлению к источнику индукторов ангиогенеза. Среди индукторов ангиогенеза следует выделить стимуляторы ангиогенеза прямого действия, которые индуцируют рост микрососудов. В качестве стимуляторов ангиогенеза могут выступать самые разнообразные факторы воздействия: вазоактивные вещества, кинины, гепарин, субстанции, продуцируемые нейтральными гранулоцитами, макрофагами, лимфоцитами и другими клетками [5].

Особенно мощными стимуляторами ангиогенеза являются гистамин, лейкотриен С4 и флавоноиды – препараты растительного происхождения, к которым относится диосмин (Флебодиа 600). Биофлавоноиды – группа водорастворимых веществ растительного происхождения, представляющих собой полиокси и полиметоксипроизводные флавона, флавонона, катехинов, антоцианидов. К биофлавоноидам, в частности, относятся гесперетин, гесперидин, рутин, эриодитол, кверцетин, кверцетрин, эскузан, эндотелон и множество других. Содержатся в листьях, цветах, плодах, корнях, древесине многих растений, особенно семейства цитрусовых и розоцветных.

Троксерутин обладает ангиопротекторным свойством, воздействуя преимущественно на капилляры и вены, уменьшает поры между эндотелиальными клетками за счет модификации волокнистого матрикса, расположенного между клетками эндотелия. Таким образом, троксерутин уменьшает проницаемость и ломкость капилляров, укрепляет сосудистую стенку и тем самым оказывает противоотечное действие.

В настоящее время клиницисты обратили внимание на успех в лечении хронических отеков конечностей различного генеза при использовании биофлавоноидов [8]. В то же время в описании фармакокинетики диосмина не указано прямого лимфостимулирующего воздействия и не изучены механизмы противоотечного эффекта со стороны лимфатической системы. Нами не найдены работы, свидетельствующие о непосредственном изучении влияния троксерутина на транскапиллярную ультрафильтрацию.

В данной работе представлены результаты экспериментального изучения разнонаправленных механизмов противоотечного воздействия биофлавоноидов для определения показаний их назначения в зависимости от этиологии хронического отека.

Это положение исходит из того, что существуют несколько причин развития отека, которые связаны с состоянием резорбционной, транспортной и емкостной лимфатической системы, а также с транскапиллярным артериовенозным обменом жидкости в интерстициальном пространстве, которые могут быть обусловлены флебодинамическими, метаболическими, воспалительными и другими факторами. Таким образом, целью работы является изучение противоотечного эффекта биофлавоноидов различного механизма воздействия.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для эксперимента были использованы 24 белых крысы, разделенных на три группы. Первая группа – интактная, состояла из 4-х животных. Вторая группа – 10 животных – приём троксерутина в течение 30-ти дней. Третья группа – 10 животных – лечение Флебодиа 600 в течение 30-ти дней. Флебодиа 600 давали животным два раза в день в период кормления из расчета дозы препарата на вес крысы.

С целью исследования действия Флебодиа 600 на эндотелий лимфатических капилляров экспериментальным животным (зрелым, нелинейным белым крысам Вистар, весом до 200 граммов) скармливали Флебодиа 600 из расчета 0,75 мг и 0,375 мг троксерутина соответственно на 100 граммов веса животного.

В качестве области исследования были использованы лимфатические и кровеносные капилляры надкостницы и фасцикулярных футляров мышц голени и бедра с ее плоскостной геометрией капиллярных сетей. Это облегчало задачу исследования проницаемости кровеносных капилляров, а также элементов регенерации эндотелиальных клеток и проведение морфометрии. В то же время лимфатическое русло собственно кожи имеет очень сложную пространственную организацию, что затрудняет приготовление гистологических препаратов в больших единицах объёма.

Рис. 1. Лимфатическое русло надкостницы интактного животного.
СЭМКП Ув. х 84.

Статистический анализ проводили стандартным набором методов c использованием компьютерной программы Statistica 6,0. На первом этапе устанавливали соответствие распределения исследуемых признаков в группах закону нормального распределения методами описательной статистики: определение основных статистических показателей (среднее значение, стандартное отклонение). Для проверки различий между группами применяли непараметрические статистические методы: в случае групп парных измерений – Т-критерий Уилкоксона. При сравнении величин в динамике внутри исследуемых групп, а также величин между группами, достоверно значимыми считались результаты при р

Рис. 2. Лимфатический капилляры фасции мышцы бедра животного
после 14- дневного применения Флебодиа 600.
Концентрация ядер эндотелиоцитов на вершине лимфатического капилляра (показано стрелками).
Импрегнация нитратом серебра по В.В.Куприянову. Ув. х 112.

Экспериментальных животных подвергали эвтаназии с помощью передозировки наркотического вещества (нембутала) через 3, 7, 14 и 30 суток приема Флебодиа 600 и троксерутина.

Исследование лимфатического русла париетальной брюшины проводили на гистологических препаратах. Для этого кусочки надкостницы и фасции импрегнировали нитратом серебра по В.В. Куприянову, а для получения данных о делении эндотелиальных клеток их окрашивали моноклональными антителами (МКА) типа PCNA, которые вступали в реакцию с белком циклином, что свидетельствовало о потенции клеток к делению. Для получения общей картины лимфатического русла надкостницы и фасцикулярных футляров мышц голени применили классический метод лимфологии – сканирующую электронную микроскопию коррозионных препаратов – СЭМКП [9] (рис.1). Это во многом помогло проведению морфометрических исследований плотности лимфатических капилляров и сосудов (рис. 3). Пролиферативную активность эндотелия лимфатических микрососудов учитывали по количеству клеток, окрашенных моноклональными антителами, в не менее чем 30-ти полях зрения одного препарата, в абсолютных единицах измерения. Кроме того, часть препаратов, для визуализации фигур митоза, окрашивали железным гематоксилином Вейгерта или обрабатывали для последующего изучения с помощью сканирующей электронной микроскопии.

Рис. 3. Разнообразные формы (стрелки) отростков лимфатических капилляров фасции голени крысы
после 30-дневного курса применения Флебодиа 600 .
Импрегнация нитратом серебра по В.В. Куприянову. Ув. х 160.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

С помощью световой микроскопии на тотальных препаратах надкостницы и фасции мышц бедра на фоне кровеносных микрососудов наблюдали различные элементы лимфатического русла: лимфатические капилляры (рис. 2, 3), создающие новые лимфатические капилляры и сети. После 14-ти и 30-ти дней на контуре лимфатических капилляров наблюдали единичные “почки” с группировкой ядер эндотелиоцитов, которые при окраске МКА показывали способность к митозу (рис. 4) [9].

По данным Борисова А.В. [10], рост лимфатических капилляров происходит путём возникновения своеобразных выростов эндотелия – “конусов роста”, “почек”. Из стенки капилляров выделяется в основное вещество соединительной ткани сплошной цитоплазматический отросток, происходит деление клеток лимфатического эндотелия, продвижение последних в цитоплазматический вырост, его канализация, а затем слияние нескольких отростков и формирование лимфатических петель. Формы отростков могут быть самые разнообразные (рис. 4).

Рис. 4. Формирование цитоплазматических выростов на 14–30 сутки
после приема Флебодиа 600 (показаны стрелкой).
На вершинах отростков лимфатических капилляров обилие ядер эндотелиоцитов.
Надкостница. Импрегнация нитратом серебра по В.В. Куприянову. Ув. х 300

Плотность лимфатического русла (табл. 1), определялась в единице объема в % (в поле зрения при стандартном увеличении х 160). Уже на 3-и сутки приема Флебодиа 600 появляются значимые различия в плотности лимфатического русла 38,17±1,7% по сравнению с интактными животными, у которых она была 36,81±1,4%. После 2-х недельного курса Флебодиа 600 плотность лимфатического русла со ставила 60,07±1,1%, т.е. увеличилась на 63±4,26% (различия значимые р=0,013). После 4-х недельно го курса Флебодиа 600 плотность лимфатического русла достоверно увеличивалась на 88±6,15% к 30-ти суткам и максимальные значения составили 69,11% (р Таблица 1
Плотность лимфатического русла надкостницы и фасцикулярных футляров мышц голени экспериментальных животных
во время приёма троксерутина и Флебодиа 600 (диосмина)

Таким образом, плотность лимфатического русла при приеме Флебодиа 600 постоянно увеличивается, что обуславливает рост объема резорбции жидкости из тканей. На тотальных препаратах была заметна тенденция к ремоделированию лимфатических сетей, путем создания анастомозов между образующимися “почками” противоположных капилляров. После 14-дневного курса лечения Флебодиа 600, и особенно после 30-дневного курса, было выявлено значительное нарастание “почкования” эндотелиоцитов лимфатических капилляров как замкнутого, так и сетевого типа (рис. 4). Пролиферирующие эндотелиальные клетки, как правило, имели овоидную форму, без определенной ориентации, были освобождены от межклеточных контактов. Пролиферация привела к демаскировке рецепторов клеточной поверхности и увеличению её общей площади, которая характеризовалась наличием большого количества выпучиваний и инвагинаций. На сканограммах создается впечатление “вспухания” клеток (рис. 5).

Рис. 5. Деление эндотелиальных клеток, поверхность их “вспучена”
(указаны стрелками от центральных указателей).
Экспериментальное животное после 30дневного курса приема Флебодиа 600.
Фасция мышцы бедра. Сканограмма. Ув. х 160.

Скопление ядер указывало на бурную митотическую активность, а при действии МКА во всех указанных регионах выявили потенцию клеток к пролиферации (табл. 2).

Таблица 2
Пролиферативная активность эндотелия лимфатических микрососудов надкостницы и фасцикулярных футляров
мышц голени белых крыс при приеме Флебодиа 600 (диосмина)

Уже с первых суток применения Флебодиа 600 наблюдалось увеличение пролиферативной активности эндотелия лимфатических микрососудов до 3,11±0,26, относительно интактных животных – 2,13±0,18 абс. ед. К третьим суткам пролиферативная активность превышала показатели интактной группы в 2 раза и составляла 4,81±0,37 абс. ед.

Пролиферативная активность после 14дневного применения Флебодиа 600 достоверно изменялась в сторону увеличения митотической активности эндотелиоцитов лимфатических капилляров и достигла 6,17±0,44 абс. ед. Максимальная активность пролиферативной активности эндотелия лимфатических микрососудов составила 8,14±1,56 и была отмечена на 30е сутки (табл. 2). В отличие от Флебодиа 600 при применении троксерутина показатели пролиферативной активности лимфатического эндотелия не изменялись и находились в пределах статистической погрешности (р>0,1).

Рис. 6. Криофрактография. Повышенная плотность кавеол в эндотелиоцитах кровеносных капилляров
у экспериментальных животных при создании лимфатического отека конечности.
Ув. х 45000.

Таблица 3
Плотность кавеол эндотелия кровеносных микрососудов надкостницы и фасции у экспериментальных животных до и после назначения флавоноидов

Исследования путей трансэндотелиального переноса в эндотелии кровеносных микрососудов проводили у экспериментальных животных (табл. 3) методом криофрактографии. При оценке криофрактографии в отношении пространственного распределения плазмолеммальных пузырьков было установлено, что они представляют собой одну из важнейших структур эндотелиоцитов. Их функцию связывают с транспортом белковых молекул. Разработка критериев идентификации плазмолеммальных пузырьков дала возможность перейти к количественной оценке их частоты и распределения в эндотелиоцитах.

Целью экспериментальных исследований явилось изучение влияния троксерутина на трансцеллюлярный транспорт и степени проницаемости кровеносных капилляров.

С помощью криофрактографии проведено изучение пространственной и количественной оценки распределения плазмолеммальных пузырьков эндотелиоцитов кровеносных капилляров. В норме плотность кавеол эндотелия кровеносных микрососудов, (табл. 3), не превышает 0,9 (в абсолютных единицах).

Рис. 7. Криофрактография. Плотность кавеол в эндотелиоцитах кровеносных капилляров
при 30дневном назначении Флебодиа 600. Ув. х 45000.

Рис. 8. Криофрактография. Значительное снижение плотности кавеол в эндотелиоцитах
кровеносных капилляров. При назначении троксерутина на 30е сутки лечения. Ув. х 45000.

Назначение троксерутина приводит к значительному уменьшению количества кавеол в эндотелии кровеносных капилляров, которое сохраняется длительное время (рис. 8). Установлено, что у троксерутина способность к снижению проницаемости кровеносных капилляров в 1,5 раза сильнее, чем у других флавоноидов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Флавоноиды имеют различные механизмы противоотечного воздействия. Дифференциальный подход в выборе фармакологических препаратов в зависимости от их преимущественного воздействия позволяют добиться максимального терапевтического эффекта.

Проведение 30дневного курса перорального лечения Флебодиа 600 у экспериментальных животных активизирует пролиферацию эндотелия лимфатических капилляров, что способствует неоангиогенезу путем почкования, ремоделирования, анастомозирования, образования новых капиллярных лимфатических сетей и, в конечном итоге, приводит к увеличению общей резорбционной площади инициального отдела лимфатической системы и тем самым к выраженной стимуляции резорбционной функции лимфатической системы.

Механизмы развития отеков могут быть обусловлены множеством различных причин на уровне как кровеносной, так и лимфатической системы. Дифференцированное назначение препаратов противоотечного действия в зависимости от механизма действия позволяет устранить соответствующее патологическое нарушение и получить максимальный терапевтический эффект.

При необоснованном назначении препарата в лучшем случае клинический эффект отсутствует, а в худшем может привести к увеличению отека.

Проведенные исследования свидетельствуют о нецелесообразности назначения Флебодиа 600 при блоках лимфатического оттока, так как препарат оказывает выраженный эффект, стимулирующий резорбционную способность, что значительно увеличивает емкостную нагрузку на лимфатическую систему. В то же время троксерутин, обладая обратным действием, показан в данных случаях, так как снижает нагрузку на лимфатическую систему.

Флебодиа 600 помимо флеботонического воздействия в своей фармакокинетике имеет механизмы прямого воздействия на лимфатическую систему, усиливает резорбцию интерстициальной жидкости, увеличивая нагрузку на лимфатическую систему, транспортная способность которой лимитирована емкостью лимфатического русла конечности [3].

Исходя из вышесказанного, назначение Флебодиа 600 (диосмина) обоснованно при интактной лимфатической системе с нормальной транспортной емкостью. В первую очередь при отеках венозной этиологии, а также отеках, связанных с травмами, воспалением и другими заболеваниями, не изменяющими пропускную способность лимфатической системы.

ВЫВОДЫ

Таким образом, экспериментальные исследования показали, что Флебодиа 600 приводит к увеличению плотности лимфатического русла, за счет образования новых лимфатических капилляров и сетей, что приводит к увеличению объема резорбции жидкости в лимфатическое капиллярное русло.

Троксерутин не оказывает непосредственного воздействия на лимфатическую систему. Противоотечные свойства троксерутина обусловлены воздействием его на уровень капиллярного кровеносного русла путем снижением проницаемости сосудистой стенки. В результате снижается поступление жидкости в интерстициальное пространство и соответственно нагрузка на лимфатическую систему.

ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES

1. Jimenez Cossio J.A. Physiology of Lympatic Oedema. Phlebology. 1994; l: 1:19–22.
2. Сатюкова Г.С., Кургузов О.П. Структура лимфатического русла кожи нижней конечности при пер- вичной слоновости: сб. науч. трудов (памяти академика Д.А. Жданова). М. 1998: 88–90.
3. Foldi M., Kubik S. Lerbuch der lymphologie fur Mediziner und Physioterapeuten. Stuttgart. 1991; 472.
4. Банин В.В. Механизм обмена внутренней среды. М.: изд. РГМУ. 2000; 278.
5. Куприянов В.В., Миронов В.А., Миронов А.А., Гурина О.Ю. Ангиогенез. М., 1993; 170.
6. Бородин Ю.М., Сапин М.Р., Этинген Л.Е., Григорьев В.Н. Общая анатомия лимфатической системы. Новосибирск: Наука.1990; 243.
7. Зербино Д.Д. Общая патология лимфатической системы. Киев: Здоров я. 1974; 160.
8. Сапелкин С.В. Отек как мера тяжести ХВН и критерий эффективности проводимой терапии. Ангиология и сосудистая хирургия. 2008; 4: 3: 79–81.
9. Караганов Я.Л., Гусев С.А., Миронов В.А. Современные методы электронной микроскопии в изучении микроциркуляции. Архив анатомии. 1980; 6: 90–110.
10. Борисов А.В. Лимфатический капилляр. Л.: ЛСГМИ. 1981; 5–15.

Комментарии