Изучение противоинсультного действия Фенотропила на модели геморрагического инсульта (интрацеребральная посттравматическая гематома) у крыс

Опубликовано в журнале:
Атмосфера. Нервные болезни  »» №1 2006

В.И. Ахапкина, Т.А. Воронина

Целью настоящего исследования явилось экспериментальное изучение терапевтических эффектов Фенотро­пила - нового ноотропного препарата с потенциальным нейропротективным и психоактивирующим действием - на модели геморрагического инсульта (интрацеребральная посттравматиче­ская гематома) у крыс.

В настоящее время эксперимен­тальное изучение сосудистых заболе­ваний мозга проводится на различных моделях ишемического и геморраги­ческого инсультов [1-4], которые со­здаются у лабораторных животных (кролики, крысы) чаще всего путем пе­режатия (разрушения) сосудов оболо­чек головного мозга или глубоких структур мозга.

В выполненном исследовании моделирование локального кровоиз­лияния в головном мозге - создание геморрагического инсульта (интраце-ребральной посттравматической ге­матомы) - проводилось согласно ме­тодике А.Н. Макаренко и соавт. (1990) [2]. Опыты проводили на белых бес­породных крысах-самцах массой 200-250 г. Крысы содержались в усло­виях вивария при свободном доступе к пище и воде.

С целью создания инсульта у крыс, наркотизированных хлоралгид­ратом (400 мг/кг, в/м), проводилась трепанация черепа и затем при помо­щи специального устройства (манд-рен-нож) и стереотаксиса осуществ­лялась деструкция мозговой ткани в области внутренней капсулы с после­дующим (через 2-3 мин) введением в место повреждения крови, взятой из-под языка животного (0,02-0,03 мл). Таким способом достигается локаль­ный аутогеморрагический билате­ральный инсульт в области внутренней капсулы (диаметр - 2 мм, глубина -3 мм) без существенных поврежде­ний вышерасположенных образова­ний мозга и неокортекса.

Во время операции и сразу после нее погибло 40% крыс с инсультом.

У выживших животных с геморра­гическим инсультом в последующем регистрировали различные невроло­гические, когнитивные и другие нару­шения поведения.

Животные были поделены на несколько групп:

• интактные крысы (I группа);
• ложно оперированные крысы, которых наркотизировали и которым затем проводили трепанацию черепа, но не осуществляли разрушения моз­говой ткани (II группа);
• животные с геморрагическим инсультом (III группа);
• животные с геморрагическим инсультом, которым вводили Фенотропил (IV группа).

Фенотропил вводили в дозе 100 мг/кг внутрь (интрагастрально, с использованием специального зон­да) через 5 ч после операции, затем -ежедневно однократно в течение 7 дней.

Контрольным животным (I, И и III групп) вводили физиологический раствор в эквивалентном объеме ин­трагастрально.

Для оценки нарушения поведения и состояния животных после гемор­рагического инсульта использовали комплекс методов, традиционно при­меняемых для этих целей в экспери­менте.

Таблица 1.
Неврологические наруше­ния функций по шкале McGrow

1. Для оценки неврологического статуса:

• метод оценки неврологического дефицита по шкале оценки инсульта (stroke-index) McGrow в модификации И.В. Ганнушкиной (1996) [5];
• метод регистрации мышечного тонуса;
• метод регистрации координации движений.

2. Для   оценки   когнитивных функций - условный рефлекс пассив­ ного избегания в темной, светлой ка мере (установка Lafayette Instrument Co., США).

3. Для оценки ориентировочно- исследовательского поведения - методика открытого поля.

4. Оценка влияния препарата на выживаемость крыс. Регистрирова­ ли гибель животных в течение 14 дней после операции.

Динамику развития нарушений, вызванных интрацеребральной пост­травматической гематомой, и влияние Фенотропила на поведение крыс на­блюдали в течение 14 сут после опе­рации с регистрацией поведения и со­стояния животных на 1-е, 3-й, 7-е и 14-е сутки после операции.

Статистическую обработку дан­ных проводили с вычислением сред­них арифметических и их доверитель­ных интервалов при р < 0,05. Для оценки достоверности результатов использовали параметрический кри­терий статистической обработки дан­ных по методу Стьюдента (t-test) и критерий %-квадрат (%²) компьютерной программы "Biostat".

Неврологический дефицит у жи­вотных определяли по шкале Stroke-index McGrow в модификации И.В. Ган-нушкиной (1977) [6]. Тяжесть состо­яния оценивалась по сумме соот­ветствующих баллов. Отмечалось количество крыс:

• с легкой симптоматикой (до 2,5 бал­лов по шкале Stroke-index) - вялость движений, слабость конечностей, односторонний полуптоз, тремор, манежные движения;
• с тяжелыми проявлениями невроло­гических нарушений (от 3 до 10 бал­лов) - парезы и параличи конечнос­тей, а также боковое положение (табл.1).

Для регистрации мышечного тону­са использовали тест подтягивания на горизонтальной перекладине [7]. В этом тесте крысы подвешиваются передними лапами на проволоку, на­тянутую на высоте 20-30 см от поверх­ности стола. Интактные крысы с нена­рушенным мышечным тонусом быстро подтягиваются и удерживаются на пе­рекладине четырьмя лапами. Невы­полнение этого рефлекса животными опытной группы свидетельствует о на­рушении мышечного тонуса и невро­логическом дефиците.

Для регистрации неврологическо­го дефицита, выражающегося в нару­шении координации движений, крыс помещали на горизонтальный стер­жень диаметром 4 см, вращающийся со скоростью 3 оборота в минуту [7]. Неспособность животных под влияни­ем препарата удерживать равновесие на стержне в течение 2 мин рассмат­ривалась как проявление нарушения координации движений.

Оценку когнитивных функций про­водили на стандартной установке ус­ловного рефлекса пассивного избега­ния (УРПИ) (Passive Avoidance) фирмы Lafayette Instrument Co. (США). Конст­руктивно установка состоит из ма­ленькой платформы, расположенной на расстоянии 1 м от пола, освещен­ной специальной лампой и соединен­ной с ней темной камеры с электрод­ным полом. Крысу помещали на осве­щенную платформу перед входом в темную камеру установки, хвостом к входному отверстию.

Для оценки норкового рефлекса регистрировали латентное время пер­вого захода в темную камеру. Крыса, предпочитая темную камеру, быстро переходит в нее.

С целью обучения крыса в темной камере получала однократное болевое раздражение электротоком (0,45 мА). Продолжительность раздражения определялась выбеганием животного из темного отсека [8]. Животное запоми­нало, что в темную камеру заходить опасно.

Тест на воспроизведение УРПИ (на сохранение памятного следа) осуще­ствляли через 24 ч после обучения, а также 3,7 и 14 сут после операции. Жи­вотное вновь помещали на освещен­ную платформу и регистрировали в те­чение 3 мин латентный период первого захода в темную камеру и время пре­бывания крысы в темной камере.

Оценка ориентировочно-исследо­вательского поведения осуществля­лась в тесте открытого поля [7]. Уста­новка "открытое поле" для крыс пред­ставляет собой камеру размером 120 х 120 см с прозрачной крышкой. Пол камеры разделен равномерно ли­ниями на 9 квадратов с 16 отверстия­ми диаметром 4 см. В процессе 3-ми­нутного пребывания крысы в откры­том поле регистрировали следующие показатели: число вставаний на зад­ние лапки (вертикальная двигательная активность), число переходов из квад­рата в квадрат (горизонтальная двига­тельная активность) и число загляды-ваний в отверстия.

Результаты исследования

Влияние Фенотропила на показатели неврологического дефицита по шкале McGrow после инсульта

В первые сутки после операции при оценке неврологических отклоне­ний у контрольных крыс с геморрагиче­ским инсультом (ГИ) показано, что поч­ти у всех (90-100%) животных наблю­дались умеренные неврологические нарушения в виде вялости и замедлен­ности движений, тогда как у ложно опе­рированных крыс эти нарушения были отмечены у 40% особей. Выраженных неврологических нарушений, прояв­ляющихся в виде манежных движений по кругу и параличей конечностей, в группе ложно оперированных живот­ных не наблюдалось, а у животных с ГИ они были отмечены в 30-40% случаев.

Фенотропил после 2-кратного введения в дозе 100 мг/кг достоверно снижал выраженность неврологиче­ских нарушений у крыс через сутки после геморрагического инсульта (табл. 2).

Влияние Фенотропила на мышечный тонус после инсульта в тесте подтягивания на перекладине

Регистрация мышечного тонуса у крыс с ГИ показала, что на 3-й сутки после инсульта ослабление мышечно­го тонуса отмечалось в среднем у 40-50%, а на 7-14-е сутки - у 36-38% животных.

У крыс, получавших Фенотропил, на 1 -е-3-и сутки ослабление мышеч­ного тонуса наблюдалось у 33-42% особей. На 7-е сутки после введения Фенотропила ослабление мышечного тонуса наблюдалось у 25% крыс, а к 14-м суткам этот показатель снижал­ся до 16%, так что различия были ста­тистически значимыми по сравнению с аналогичными показателями у ин­сультных животных (табл. 3).

Влияние Фенотропила на координацию движений после инсульта в тесте вращающегося стержня

Исследование динамики наруше­ний координации движений у крыс с ГИ показало, что на 1-е-3-и сутки по­сле инсульта нарушение координации движений отмечалось у 48-50% жи­вотных, а на 7-14-е сутки - у 38-45% выживших животных (табл. 4).

Фенотропил в дозе 100 мг/кг ос­лаблял нарушения координации дви­жений у крыс. Выраженные и статис­тически значимые результаты лечения были получены на 7-14-е сутки после инсульта (см. табл. 4).

Влияние Фенотропила на когнитивные функции животных с геморрагическим инсультом

Выполнение норкового рефлек­са. Норковый рефлекс грызунов осно­ван на стремлении к ограниченному затемненному пространству.

Контрольные крысы (интактные и ложно оперированные) при помещении их на освещенную платформу быстро, с коротким латентным перио­дом переходят в темную камеру.

Таблица 2.
Влияние Фенотропила (100 мг/кг, внутрь) на неврологический дефицит (по шкале McGrow) у крыс после геморрагического инсульта. Приведено количество жи­вотных с различной неврологической симптоматикой (%) в 1-е сутки после операции

* Достоверность отличий от инсультных крыс при р < 0,05 (х²).

Таблица 3.
Влияние Фенотропила на мышечный тонус животных в тесте горизон­тальной перекладины после геморрагического инсульта

Обозначения: n/N - количество не подтянувшихся животных (п) из общего количества (N). * Достоверность отличий по сравнению с группой ложно оперированных крыс при р < 0,05 W). ** Достоверность отличий по сравнению с группой инсультных крыс при р < 0,05 (х²).

Таблица 4.
Влияние Фенотропила на координацию движений животных в тесте вра­щающегося стержня после геморрагического инсульта

Обозначения: n/N - количество не удержавшихся животных (п) из общего количества (N). * Достоверность отличий по сравнению с группой ложно оперированных крыс при р < 0,05 (if). ** Достоверность отличий от крыс с ГИ при р < 0,05 (х²).

Таблица 5.
Влияние Фенотропила на выполнение норкового рефлекса. При­ведено латентное время захода в тем­ную камеру при обучении норковому ре­флексу в 1 -е сутки после операции

У крыс с ГИ норковый рефлекс не нарушается, но увеличивается латент­ное время его выполнения (табл. 5).

Фенотропил не нарушает выпол­нение норкового рефлекса, и при ис­пользовании препарата латентное время выполнения рефлекса сопоста­вимо с норковым рефлексом у крыс с ГИ (см. табл. 5).

Таблица 6.
Влияние Фенотропила на воспроизведение УРПИ у крыс с интрацеребральной посттравматической гематомой

* Достоверность отличий по сравнению с группой ложно оперированных крыс при р < 0,05 (t-тест Стьюдента; %² ** Достоверность отличий по сравнению с инсультными животными при р < 0,05 (t-тест Стьюдента; %²).

Нарушения памяти животных.

Установлено, что в контрольной груп­пе крыс, получавших в течение всего эксперимента физиологический рас­твор (интактные), при воспроизве­дении УРПИ через 24 ч после обу­чения (получение болевого раздра­жения в темном отсеке камеры) 80% животных помнили об ударе током и не заходили в темную "опасную" ка­меру в течение всего времени наблю­дения.

Через сутки после обучения кон­трольные интактные и ложно опери­рованные крысы хорошо помнили об ударе током в темной камере, и 70-80% животных не заходили в этот опасный отсек. Остальные крысы заходили в темный отсек с большим ла­тентным периодом (табл. 6).

Таблица 7.
Влияние Фенотропила на ориентировочно-исследовательское поведе­ние и двигательную активность животных в условиях методики открытого поля после геморрагического инсульта

*Достоверность отличий по сравнению с группой ложно оперированных крыс при р < 0,05 (t-тест Стьюдента). ** Достоверность отличий по сравнению с инсультными крысами при р < 0,05 (t-тест Стьюдента).

У крыс с геморрагическим инсуль­том (ГИ) через сутки после обучения достоверно уменьшилось латентное время захода в темную камеру. Только 25% животных совсем не зашли в тем­ную камеру, т.е. помнили об ударе то­ком, у 75% крыс память была наруше­на (см. табл. 6).

Фенотропил в дозе 100 мг/кг при однократном введении через 5 ч после операции (воспроизведение УРПИ че­рез сутки после обучения) увеличивал до 40% число животных с сохраненной памятью (животные с ГИ - 25%) и уве­личивал латентное время захода в темную камеру (на 48%). Эффект при этом был статистически незначим.

Через 3 сут после операции на­рушения памяти у животных с ГИ сохра­нялись на том же уровне (см. табл. 6).

После 3-кратного введения Фено­тропила отмечалось дальнейшее уве­личение латентного времени захода в темную камеру и увеличение числа жи­вотных, не зашедших в камеру; эти эф­фекты Фенотропила, однако, остава­лись статистически незначимыми.

Через 7 и 14 сут после обучения ин­тактные и ложно оперированные живот­ные хорошо помнили о негативной си­туации и выполняли УРПИ (см. табл. 6).

В сравнении с ними у инсультных животных на 7-14-й день после ГИ и обучения память на получение бо­левого раздражения в темной камере была достоверно нарушена. Причем это нарушение памяти было выражено в большей степени в сравнении с по­казателями через 1 и 3 сут после опе­рации. Так, через 7 сут только 16% жи­вотных помнили о негативном раздра­жении, а остальные крысы заходили в темный опасный отсек уже через 28 с. А через 14 сут только 9% животных со­хранили УРПИ (см. табл. 6).

Таблица 8.
Влияние Фенотропила на выживаемость животных после ГИ

Обозначения: n/N - количество погибших животных (п) из общего количества (N). * Достоверность отличий по сравнению с группой ложно оперированных крыс при р < 0,05 (х²). ** Достоверность отличий по сравнению с инсультными крысами при р < 0,05 (х²).

Фенотропил, введенный крысам в дозе 100 мг/кг в течение 7 дней, вос­станавливал нарушения памяти в постинсультный период на 7-й и 14-й дни после операции. Под влиянием препарата наблюдалось статисти­чески значимое увеличение (до 40%) числа помнивших негативную ситуа­цию животных (у крыс с ГИ - 9%). Примерно в 3 раза увеличивалось по сравнению с инсультными крысами латентное время захода в темную опасную камеру (см. табл. 6).

Таким образом, Фенотропил при повторном введении обладает выра­женной способностью восстанавли­вать нарушенную при геморрагичес­ком инсульте память на модели услов­ного рефлекса пассивного избегания.

Ориентировочно-исследова­тельское поведение. Изучение ори­ентировочно-исследовательского по­ведения в условиях методики открыто­го поля показало, что в 1 -е сутки после операции у крыс с ГИ отмечалось зна­чительное, практически в 2 раза, сни­жение суммарных показателей двига­тельной активности и исследователь­ского поведения. Сходные показатели поведения крыс наблюдались и на 14-й день после ГИ, хотя животные были в эти сроки несколько активнее (табл. 7).

Фенотропил при регистрации эф­фекта через 3 сут после ГИ увеличи­вал суммарные показатели поведе­ния до уровня показателей поведения интактных и ложно оперированных животных (см. табл. 7).

При регистрации эффекта после 7 дней введения Фенотропила суммар­ный показатель двигательного поведе­ния по сравнению с группой крыс с ГИ увеличивался в 2,7 раза (см. табл. 7).

Через 14 сут после операции акти­вирующий эффект Фенотропила на поведение сохранялся.

Влияние Фенотропила на выживаемость крыс с геморрагическим инсультом

Во время операции и непосредст­венно после операции погибло 40% крыс.

Выживших в первые часы после ГИ животных наблюдали в течение 14 сут.

Как видно из табл. 8, в течение 7 сут после операции в группе ложно оперированных крыс гибели животных не наблюдалось, а на 14-е сутки 1 кры­са из 10 погибала.

В группе крыс с ГИ в течение 1-х суток погибло 23% животных, а к 14-му дню этот показатель достиг 57% (см. табл. 8).

Фенотропил в дозе 100 мг/кг внутрь ежедневно в течение 7 дней полностью предупреждал гибель крыс с ГИ (см. табл. 8).

Выводы

В результате проведенных ис­следований показано, что по срав­нению с ложно оперированными жи­вотными у крыс с геморрагическим инсультом (интрацеребральной пост­травматической гематомой) наблю­даются: выраженный неврологичес­кий дефицит, нарушение координа­ции движений, ослабление процес­сов обучения и памяти и повышение показателей гибели животных. При этом отмечалось углубление патоло­гической симптоматики к 14-му дню наблюдения.

Фенотропил при введении живот­ным в дозе 100 мг/кг через 5 ч после операции, а затем ежедневно в тече­ние 7 дней вызывает значительное уменьшение выраженности постинсультных нарушений. Препарат улуч­шает показатели неврологического дефицита по шкале McGrow уже через сутки после инсульта, а при курсовом применении повышает мышечный то­нус и улучшает координацию дви­жений на 7-е и 14-е сутки после ин­сульта. Фенотропил при повторном применении восстанавливает нару­шенную в результате инсульта память, улучшая воспроизведение условного рефлекса пассивного избегания на 7-е и 14-е сутки после инсульта. Наиболее ярким эффектом Фенотропила являет­ся его способность полностью преду­преждать гибель животных с геморра­гическим инсультом.

Список литературы
1. Воронина Т.Д. // Вестник Российской академии медицинских наук. 2000. Т. 9. С. 27.
2. Макаренко А.Н. и др. А. с. № 1767518 от 03.11.1990.
3. Jackowski A. et al. // J. Cerebral Blood Flow and Metabolism. 1990. V. 10. P. 835.
4. Smith S. et al. // Neuroscience. 1997. V. 77. №4. P. 1123.
5. Ганнушкина И.В. //Журн. невропатол. и психиатр. 1996. № 1. С. 14.
6. Ганнушкина И.В. Функциональная ан- гиоархитектоника головного мозга. М., 1977. С. 224.
7. Воронина Т.А., Середенин С.Б. Методи­ ческие указания по изучению транкви­ лизирующего (анксиолитического)дей­ ствия фармакологических веществ // Руководство по экспериментальному (доклиническому)   изучению   новых фармакологических веществ. М., 2000. С. 126-130.
8. ВоронинаТ.А., Островская Р.У. Методи­ ческие указания по изучению ноотроп- ной активности фармакологических веществ // Руководство по экспери­ ментальному (доклиническому) изуче­ нию  новых фармакологических  ве­ ществ. М., 2000. С. 153-158.  

Фенотропил® - Досье препарата

Комментарии