Полусинтетические флавоцитохромы, полученные путем ковалентного связывания рибофлавина с цитохромом Р450 2В4, катализировали Н2О2-зависимые реакции n-гидроксилирования анилина, N-деметилирования амидопирина и О-деалкилирования n-нитроанизола. Скорости Н2О2-зависимых реакций флавоцитохрома существенно превышали скорости соответствующих NADH-зависимых реакций и были сравнимы со скоростями соответствующих пероксид-зависимых реакций, катализируемых цитохромом Р450 2В4. Определены кинетические параметры (Кm и Kcat) пероксид-зависимых реакций флавоцитохрома Р450 2В4. Цианид натрия и специфический ингибитор цитохрома Р450 - SKF-525 А бета,бета-диэтиламиноэтилдифенилпропилацетат) ингибируют пероксидзависимые реакции флавоцитохрома.
Образование активных форм кислорода, генерируемых флавоцитохромом 2В4, регистрировали по интенсивности хемилюминесцентного ответа в присутствии люминола. Показано, что интенсивность хемилюминесценции систем цитохром Р450 2В4 - пероксид водорода - люминол и флавоцитохром Р450 2В4 - пероксид водорода - люминол уменьшается в присутствии цианид-ионов, образующих комплекс с окисленной формой железа гема, что указывает на участие гема в образовании активных форм кислорода.
Ключевые слова: цитохром Р450, флавоцитохром 2В4, пероксидазная активность, хемилюминесценция.
ВВЕДЕНИЕ. Природные флавоцитохромы (цитохром Р450 ВМ3, нитрооксидсинтаза) содержат два реакционноспособных домена в составе одной полипептидной цепи: гемсодержащий и флавинсодержащий [1]. Флавины могут генерировать пероксиды в процессе активации кислорода или взаимодействовать с пероксидами с образованием активных форм кислорода [2, 3]. Исходя из этого особый интерес представляет изучение процесса пероксид-зависимого окисления субстратов, катализируемого полусинтетическим флавоцитохромом и роли флавинов в этом процессе. Флавоцитохромы, полученные нами ковалентным связыванием рибофлавина с цитохромом Р450 2В4 [4], катализировали реакции NAD(P)H-зависимого n-гидроксилирования анилина и N-деметилирования амидопирина и N,N-диметиланилина. Известно, что цитохром Р450 в присутствии пероксида водорода или органических пероксидов катализирует окисление многих субстратов микросомальной системы. В настоящей работе были исследованы Н2О2-зависимые реакции n-гидроксилирования анилина, N-деметилирования амидопирина и О-деалкилирования n-нитроанизола, катализируемые флавоцитохромом Р450 2В4. В работе использовали флавоцитохромы, содержащие 8-10 молекул рибофлавина на 1 молекулу цитохрома Р450 2В4. Ранее было показано, что такие флавоцитохромы наиболее активны в NADH-зависимых реакциях, катализируемых полусинтетическим флавоцитохромом 2В4 [4].
МЕТОДИКА. В работе использовали следующие реактивы: NADH, рибофлавин ("Reanal", Венгрия), Sephаdex-G25 ("Pharmacia", Швеция), люминол ("Mercк", Германия), каталаза (активность 39000 U/mg, "Serva", Германия), остальные реактивы были отечественного производства.
Спектральные измерения производились на спектрофотометрах "Beckman DU-65" (США), "Hitachi 537" (Япония) и хемилюминометре LKB-1205 (Швеция).
Цитохром Р450 2В4 был выделен и очищен как описано ранее [5]. Флавоцитохром 2В4 был получен по [4].
Скорости NADH и Н2О2-зависимого n-гидроксилирования анилина, N-деметилирования амидопирина и О-деалкилирования n-нитроанизола определяли по [6].
Инициирование свободнорадикального окисления люминола осуществляли введением Н2О2 (32mM) в систему, содержащую цитохром Р450 2В4 или флавоцитохром 2В4. Концентрацию Н2О2 определяли спектрофотометрически, используя эпсилон240=43,6 М-1см-1 [7] или калийперманганатным методом [8].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. Кинетические параметры Н2О2-зависимых реакций, катализируемых полуминтетическим флавоцитохромом 2В4.
Цитохром Р450 в присутствии органических пероксидов и пероксида водорода катализирует окисление субстратов микросомальной монооксигеназной системы. Целью нашей работы было исследование роли железа гема и флавиновых остатков, ковалентно связанных с цитохромом Р450, в Н2О2-зависимых реакциях. Были проведены реакции n-гидроксилирования анилина, N-деметилирования амидопирина и О-деалкилирования n-нитроанизола. Реакции начинали добавлением пероксида водорода к флавоцитохрому в присутствии субстратов.
Константу Михаэлиса (Km) определяли как для субстратов (анилин, амидопирин), так и для ко-субстрата (Н2О2). Концентрацию пероксида водорода варьировали от 5 до 1200 mМ. Концентрацию амидопирина меняли от 0,4 до 9,6 mМ, а концентрацию анилина - от 0,75 до 24 mМ. Полученные данные представлены в таблице 1. Значения Km для полусинтетического флавоцитохрома сходны с данными, полученными для микросом, олигомеров цитохрома Р450 2В4 и мономерного цитохрома Р450 2В4 [5]. Это может свидетельствовать о сходных механизмах пероксидазных реакций, катализируемых цитохромом Р450 и полусинтетическим флавоцитохромом.
Полусинтетический флавоцитохром достаточно эффективно метаболизирует в Н2О2-зависимых реакциях субстраты I и II типа (амидопирин и анилин). Значения каталитических констант (Kcat) для реакций n-гидроксилирования анилина и N-деметилирования амидопирина близки к значениям Kcat, полученным для аналогичных систем (микросом и олигомеров цитохрома Р450 2В4 (Табл. 2). Значение Kcat реакции Н2О2-зависимого n-гидроксилирования анилина, катализируемой флавоцитохромом 2В4, примерно в 2 раза ниже, чем Kcat аналогичной реакции в случае микросом и цитохрома Р450 2В4 (олигомера). Причиной этого может быть "непродуктивная" активация пероксида водорода на флавиновых остатках, которая не приводит к увеличению скорости метаболизма субстрата. Использование в реакциях, катализируемых полусинтетическим флавоцитохромом 2В4, пероксида водорода с концентрацией > 600 mM, приводит к инактивации флавоцитохрома. Этот процесс может быть связан с меньшей устойчивостью флавоцитохрома или с генерированием активных форм кислорода (АФК), разрушающих фермент, на флавиновых остатках [2, 3].
Ранее было показано, что полусинтетические флавоцитохромы 2В4, содержащие различные количества ковалентно связанного рибофлавина, не катализировали NADH-зависимые реакции О-деалкилирования n-нитроанизола и 7-этоксикумарина [4]. При использовании в качестве донора активных форм кислорода Н2О2 происходит катализируемое флавоцитохромом О-деалкилирование n-нитроанизола, каталитической константы пероксид-зависимого О-деалкилирования Kcat 1,3+0,2 min-1. Близкие значения Kcat (6,9 min-1) для реакции О-деалкилирования n-нитроанизола, катализируемой цитохромом Р450 2В4 и гидропероксидом кумила, были получены ранее [9].
Влияние цианида натрия на Н2О2-зависимые реакции флавоцитохрома 2В4.
Цианид-анион является ингибитором гемопротеинов, взаимодействуя с железом гема в окисленном состоянии (Fe3+). Так как, в пероксид-зависимых реакциях железо гема цитохрома Р450 находится в окисленном состоянии, цианиды являются эффективными ингибиторами этих реакций [10].
Таблица 1. Кинетические параметры Н2О2-зависимых реакций полусинтетического флавоцитохрома 2В4
| Реакции | Кm, mМ | Kcat, min-1 | Kcat/Km ,min-1mM-1 | ||
| Н2О2 | субстрат | Н2О2 | субстрат | ||
| n-гидроксилирование анилина | 124+/-10 | 1,83+/-0,1 | 11+/-1 | 0,089 | 6,01 |
| N-деметилирование амидопирина | 165+/-15 | 0,83+/-0,08 | 16+/-1 | 0,097 | 19,3 |
Таблица 2. Сравнение каталитических констант Н2О2 - зависимых реакций для разных систем
| Реакции | Кcat, min-1 | ||
| микросомы | цитохром Р450 2В4, олигомеры | флавоцитохром 2В4 | |
| n-гидроксилирование анилина | 38 [5] | 24 [5] | 11 |
| N-деметилирование амидопирина | - | 20 [5] | 16 |
Таблица 3. Влияние цианида натрия на Н2О2-зависимые реакции, катализируемые цитохромом Р450 2В4 и флавоцитохромом 2В4 (в таблице указан процент ингибирования соответствующих реакций)
| Реакции | Фермент, катализирующий реакцию | |
| цитохром Р450 2В4 | флавоцитохром 2В4 | |
| Н2О2-зависимое n-гидроксилирование анилина | 75-85% | 55-65% |
| Н2О2-зависимое N-деметилирование амидопирина | 85-95% | 30-40% |
Инкубационная смесь содержала 100 mM калий-фосфатный буфер, рН 7,4, 1mM флавоцитохром 2В4. При определении Кm для Н2О2 концентрация амидопирина или анилина была соответственно 8 mM и 3 mM. При определении Кm и Kcat для субстратов, концентрация Н2О2 была 0,5М. Избыток Н2О2 разлагали добавлением 16000-48000 U/мл каталазы
При проведении Н2О2-зависимых реакций, катализируемых флавоцитохромом 2В4, в присутствии 10 mМ NaCN наблюдается ингибирование реакции N-деметилирования амидопирина и n-гидроксилирования анилина. В качестве контроля были проведены аналогичные пероксид-зависимые реакции, катализируемые цитохромом Р450 2В4 (таблица 3). Как видно из таблицы, реакции Н2О2-зависимого n-гидроксилирования анилина, катализируемые флавоцитохромом, ингибируются цианидом на 55-65%, в то время как, аналогичные реакции, катализируемые цитохромом Р450 2В4, ингибируются более, чем на 75%. Для реакции Н2О2-зависимого N-деметилирования амидопирина наблюдается следующий уровень ингибирования цианидом натрия: реакции, катализируемые флавоцитохромом, ингибируются на 30-40%, а реакции, катализируемые цитохромом Р450 2В4 - на 85-95%.
При исследовании Н2О2-зависимых реакций макрофагальной NO-синтазы, которая является самодостаточной монооксигеназой и содержит в одной полипептидной цепи и гем, и флавины, было показано, что реакция образования NO2-/NO3- из NG-гидрокси-L-аргинина ингибируется 10 mM KCN на 55%. [10].
Влияние специфического ингибитора цитохрома Р450 2В4-SKF-525 А на Н2О2-зависимые реакции,катализируемые флавоцитохромом 2В4.
SKF-525 A (бета,бета-диэтиламиноэтилдифенилацетат) - специфический ингибитор цитохромов Р450. SKF-525 A в концентрации 0,01 мМ ингибировал пероксид-зависимые реакции n-гидроксилирования анилина и N-деметилирования амидопирина, катализируемые флавоцитохромом 2В4. Для сравнения в аналогичных условиях были проведены аналогичные реакции, катализируемые цитохромом Р450 2В4. Добавление SKF-525 А к реакционной смеси снижало образование продукта в реакциях H2O2-зависимого n-гидроксилирования анилина на 85-95% и на 65-75%, в случае реакций, катализируемых цитохромом и флавоцитохромом, соответственно. Реакции Н2О2-зависимого N-деметилирования амидопирина ингибировались SKF-525 А на 90-95% для реакций, катализируемых цитохромом Р450, и на 70-75% для реакций, катализируемых флавоцитохромом (таблица 4). Как для реакции n-гидроксилирования анилина, так и для реакции N-деметилирования амидопирина, катализируемых флавоцитохромом, ингибирование SKF-525А в среднем на 20% меньше, чем для аналогичных реакций, катализируемых цитохромом Р450.
В чем же причина того, что реакции, катализируемые флавоцитохромом 2В4, ингибируются цианидом натрия и SKF-525 А слабее, чем пероксид-зависимые реакции цитохрома Р450 2В4. Можно предложить два объяснения этого явления. Во-первых, в результате ковалентного связывания молекул рибофлавина может несколько изменяться конформация флавоцитохрома и, вследствие этого, может осложниться доступ к каталитически активному центру фермента и измениться прочность связывания цианид-ионов с железом гема. Молекулы рибофлавина также могут закрывать доступ к гему. Во-вторых, образование активных форм кислорода из Н2О2 может происходит не только на железе гема, но и на изоаллоксазиновых остатках рибофлавинов [2, 3]. Это не исключает возможности участия флавинов в пероксидазных реакциях.
Исследование хемилюминесценции люминола в системе флавоцитохром 2В4-пероксид водорода
Для регистрации образования активных форм кислорода исследовалась люминол-зависимая хемилюминесценция систем: цитохром Р450 2В4-Н2О2, флавоцитохромом 2В4 - NADH, флавоцитохромом 2В4-Н2О2 в присутствии люминола.
Люминол взаимодействует с гидроксильным радикалом (ОН.) и в меньшей степени с супероксид-анион радикалом (О2 -.). В результате образуется активный радикал люминола, хемилюминесценция которого регистрируется. [8, 9, 10]. В отсутствие хотя бы одного из компонентов системы свечение не регистрировалось.
В опытах по регистрации образования активных форм кислорода в системе флавоцитохром 2В4 - NADH методом хемилюминесценции не обнаружено люминесценции люминола, что свидетельствует об отсутствии в реакционном объеме частиц, (ОН· или О2·-), способных взаимодействовать с люминолом. В то же время, в системах: цитохром Р450 2В4-Н2О2, или флавоцитохром 2В4-Н2О2 идет генерация активных форм кислорода, регистрируемая по хемилюминесценции люминола.
Рисунок.
Н2О2-зависимая хемилюнесценция цитохрома Р450 2В4 и флавоцитохрома
Р450 2В4 в присутствии люминола. Смесь объемом 1 мл содержала 200 мкМ люминол,
0,1 мкМ цитохром или флавоцитохром, 32 мМ Н2О2, 10 мМ NaCN.
Таблица 4. Влияние SKF-525 А на Н2О2-зависимые реакции, катализируемые цитохромом Р450 2В4 и флавоцитохромом 2В4 (в таблице указан процент ингибирования соответствующих реакций)
| Реакции | Фермент, катализирующий реакцию | |
| цитохром Р450 2В4 | флавоцитохром 2В4 | |
| Н2О2-зависимое n-гидроксилирование анилина | 85-95% | 65-75% |
| Н2О2-зависимое N-деметилирование амидопирина | 90-95% | 70-75% |
Хемилюминесценция регистрировалась сразу после добавления Н2О2 (конечная концентрация в пробе - 32 mМ). Максимум хемилюминесценции наблюдался через 2-3 секунды после добавления пероксида водорода. Затем наблюдалось постепенное снижение интенсивности хемилюминесценции. Кинетические кривые хемилюминесценции приведены на рис. 1. Меньшая интенсивность хемилюминесценции флавоцитохрома по сравнению с цитохромом Р450 2В4 может быть связана с тушением хемилюминесценции флавинами или с меньшей активностью флавоцитохрома 2В4 как генератора активных форм кислорода в пероксид-зависимых реакциях.
Таблица 5. Ингибирование цианидом натрия интенсивности хемилюминесценции
| ФЕРМЕНТ | % ингибирования по максимуму хемилюминесценции | % ингибирования по светосумме хемилюминесценции |
| Цитохром Р450 2В4 | 59 | 54 |
| флавоцитохром 2В4 | 29 | 46 |
Таблица 6. Ингибирование SKF 525 А интенсивности хемилюминесценции
| ФЕРМЕНТ | % ингибирования по максимуму хемилюминесценции | % ингибирования по светосумме хемилюминесценции |
| Цитохром Р450 2В4 | 90 | 83 |
| флавоцитохром 2В4 | 63 | 66 |
Генерация активных форм кислорода, катализируемая Н2О2, исследовалась также в присутствии ингибиторов цитохрома Р450: 10mM NaCN и SKF-525 А. Рассчитывали процент ингибирования образования активных форм кислорода, получаемых в результате взаимодействия пероксида водорода (концентрация - 32 mM) и цитохрома Р450 или флавоцитохрома 2В4( концентрация - 0,1 mМ). Результаты ингибирования, рассчитанные с использованием данных по максимуму хемилюминесценции, приведены в таблице 5 и 6. Данные по ингибированию люминол-зависимой хемилюминесценции свидетельствуют, как и следовало ожидать, об ингибировании образования активных ингибитором SKF-525 А реакций Н2О2-зависимого n-гидроксилирования анилина и N-деметилирования амидопирина (таблица 3 и 4).
Таким образом, исследованы Н2О2-зависимые реакции n-гидроксилирования анилина, N-деметилирования амидопирина и О-деалкилирования n-нитроанизола, катализируемые полусинтетическим флавоцитохромом.
Скорости Н2О2-зависимых реакций флавоцитохрома были сопоставимы со скоростями соответствующих пероксид-зависимых реакций, катализируемых цитохромом Р450 2В4.
ЛИТЕРАТУРА
1. Шумянцева В.В., Авдеенко Ю.Л., Москвитина Т.Л., Арчаков
А.И., (1997) Вопр. мед. химии, 43, 67-81.
2. Bruice T. C., (1980) Acc. Chem. Res, 13, 256-262.
3. Massey V., (1994) J.Biol. Chem., 269, N.36, 22459-22462.
4. Shumyantseva V.V., Uvarov V.Yu., Byakova O.E., Archakov A.I.,
(1996) Biochem. Mol. Biol. Int., 38, 829-838.
5. Канаева И.П., Скотцеляс Е.Д., Кузнецова Г.П., Антонова Г.И.,
Бачманова Г.И., Арчаков А.И. (1985) Биохимия, 50, 1382-1388.
6. Kanaeva I.P., Dedinskii I.R., Skotselyas E.D., Krainev A.G.,
Guleva I.V., Sevrukova I.F. (1992) Arch. Biochem. Biophys., 298,
N.2, 395-402.
7. Теселкин Ю.О., Бабенкова И.В., Любицкий О.Б., Клебанов Г.И.,
Владимиров Ю.А. (1997) Вопр. мед. химии, 43, 87-93.
8. Дроздов Н.С., Матеранская Н.П. (1970) Практикум по биологической
химии, М., Высшая школа, 73.
9. Uvarov V.Yu., Tretiakov V. E., Leschenko A.V., Dzuzenova C.
S., Tretiakova L.Z., Rukavishnikov I.G., Archakov A.I., (1989)
Eur. J. Biochem., 181, 391-396.
10. Pufalt R., Wishnak J.S., Martella M.A., (1995), Biochemistry,
34, 1930-1941.
11. Владимиров Ю.А., Азизова О.А., Деев, (1991) Свободные радикалы
в живых системах. Итоги науки и техники. Серия "Биофизика",
29, 14-18; 28-31. Изд-во ВИНИТИ.
12. Русь О.Б., Пучкаев А.В., Метелица Д.И. (1996) Биохимия, 61,
1813-1824.
13. Vladimirov Yu.A., (1986) Free Radicals, Agening and Degenerative
Deseases. New Jork, London: Alan R. Liss Inc., 141-195.
HYDROGEN PEROXIDE- SUPPORTED OXIDATION OF SUBSTRATES BY FLAVOCYTOCHROME 2B4
V.V. SHUMYANTSEVA, T. L. MOSKVITINA, L. YU. AVDEENKO, T. V. BULKO, A.N.
OSIPOV* , A.I. ARCHAKOV
Institute of Biomedical Chemistry, Pogodinskaya st., 10, 119832 Moscow,
Russia, Fax (95) 245-08-57. E.mail: inst@ibmh.msk.su
*Department of Biophysics, Russian State Medical University
Semisynthetic flavocytochromes, obtained by covalent binding of riboflavins with cytochrome P450 2B4, were able to catalyse H2O2 -supported aniline p-hydroxylation, amidopyrine N-demethylation and p-nitroanisole O-dealkylation. Rates of these reactions were considerably higher than the rates of corresponding NAD(P)H-dependent reactions and comparable with H2O2 -dependent reactions, catalysed by cytochrome P450. Kinetic parameters (Km and Kcat) of hydrogen peroxide-supported oxidation of aniline, amidopyrine and p-nitroanisole in the presence of flavocytochrome 2B4 were determined. Cyanide and SKF-525 A inhibited H2O2-dependent reactions of flavocytochrome 2B4. The intensity of luminol chemiluminescence in the presence of hydrogen peroxide was studied. Chemiluminescent response was shown to be influenced by cyanide ions and SKF 525 A. The difference in chemiluminescence intencity of cytochrome P450 2B4 and semisynthetic flavocytochrome 2B4 was found.
Key words: cytochrome P450 2B4, flavocytochrome 2B4, hydrogen peroxide-supported reactions, chemiluminescence.
| сентябрь 2000 |